慢性肾功能不全对巨噬细胞线粒体再生的影响及机制

发布时间：2018-08-26 07:09

【摘要】：研究背景慢性肾脏病已成为公共卫生系统的重大负担[1],不仅给患者和家属带来巨大苦痛,也给社会带来巨大的经济负担。慢性持续性炎症是慢性肾脏病(CKD)的一个显著特征,它是CKD进展的一个独立的危险因素,与患者的预后不良密切相关[2]。研究表明：这种慢性持续性炎症的存在能够使促炎症因子分泌如IL-1、IL-6、TNF-a、hsCRP增加,从而导致炎症反应失控[3]。慢性肾脏病状态下的这种慢性持续性炎症的发生机制,目前还没有完全阐明。线粒体被称为真核细胞重要的“能量供应站”,因为它能够通过氧化磷酸化作用产生大量的能量供机体代谢所需[4]。在正常细胞内,线粒体再生和降解是平衡的,AMPK及PGC1α是线粒体再生和功能的主要调控因子,当PGC1α被AMPK磷酸化或者SIRT1去乙酰化激活时,其下游指标如NRF1、NRF2、TFAM等表达增加,从而使线粒体DNA拷贝数、线粒体数量及氧化磷酸化相关酶如COX、ATP合酶等表达增加,以此来维持细胞正常的能量代谢[5],一旦这种平衡受损,则会导致氧化应激的发生及细胞代谢下降[6]。线粒体在营养物质利用及能量产生方面起着重要作用,一旦线粒体在细胞水平功能受损,则会使整个机体代谢平衡紊乱,从而导致疾病的发生[7]。许多研究表明：线粒体在神经退行性变、2型糖尿病、心血管病、癌症等疾病的形成过程中起着重要的作用,其线粒体再生及功能障碍可能为主要机制之一[5,8,9]。巨噬细胞是一种很重要的固有免疫细胞,它主要有两种不同的表型：促炎症因子M1型和抗炎症因子M2型,M1型巨噬细胞能够分泌很多促炎症因子且有杀菌功能,而M2型巨噬细胞分泌的抗炎症因子主要有创伤愈合和组织修复的作用[10]。研究表明：巨噬细胞介导的炎症在许多代谢性疾病如：肥胖、糖尿病等疾病的发生与发展中起重要作用,而AMPK是连接巨噬细胞性炎症及线粒体代谢的重要枢纽,即AMPK活性的增强能够减轻巨噬细胞介导的炎症,但同时AMPK也是调控线粒体再生及能量代谢的一个重要原件[11],提示巨噬细胞介导的炎症的发生跟线粒体再生障碍有关。且最新的研究也发现,线粒体再生在巨噬细胞活化中发挥重要作用[12]。线粒体再生障碍可导致巨噬细胞炎症过度活化[13],从而导致许多炎症性疾病的发生。许多研究表明：巨噬细胞浸润是许多肾小球及。肾小管疾病的显著特征[14],且巨噬细胞介导的炎症在肾脏病的发生与发展中起着重要的作用,例如：M1型巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-a等促炎症因子能够促进肾脏结构和功能的损害[15],但这种慢性肾脏病状态下巨噬细胞介导炎症的发生机制目前还不清楚。免疫和能量代谢在分子、细胞、器官及机体水平上是紧密联系的,慢性肾脏病也是一种代谢性炎症性疾病,慢性肾脏病状态下巨噬细胞介导的炎症是否也跟线粒体再生有关呢?因此探讨代谢性因素激活免疫细胞的机制对临床防治代谢性炎症有重要意义。本研究的科学假说：慢性肾脏病作为一种慢性低度炎症性疾病,它的发生跟巨噬细胞线粒体再生障碍有关,我们从巨噬细胞线粒体再生障碍的角度探讨巨噬细胞活化异常,寻求慢性肾脏病患者代谢性炎症发生、发展的潜在机制。我们研究了5／6肾切大鼠腹腔来源噬细胞相线粒体再生相关指标的变化,此外,我们也用尿毒症血清刺激大鼠腹腔来源巨噬细胞及人巨噬细胞THP-1,探讨慢性肾功能不全的情况下线粒体再生是否发生障碍。同时我们也用AMPK激活剂AICAR刺激及携带有AMPK基因的腺病毒转染入正常大鼠腹腔来源的巨噬细胞,用相关浓度的尿毒症血清刺激AMPK活化后的大鼠腹腔来源巨噬细胞,观察线粒体再生相关通路的变化情况,来探讨AMPK活化对尿毒症血清抑制线粒体的干预作用。研究方法：第一部分：慢性肾功能大鼠腹腔来源巨噬细胞相关实验一、二步法5/6肾切除建立慢性肾衰模型 1、腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,俯卧位定于鼠台上。 2、酒精消毒,于大鼠左腹部中1／3脊柱旁开2-3cm处行纵行切口,切口长度约为2-3cm。 3、依次切开皮肤和皮下组织,并剪开肌肉暴露肾脏,剥离肾包膜,用无损伤血管钳夹住肾蒂,切除肾脏的上下极约占左肾的2/3,明胶海绵压紧上下极创面止血,放松血管钳,观察创面不再渗血后还纳肾脏回腹腔,逐层缝合肌层及皮肤,酒精消毒手术切口。缝合前,腹腔内滴注青霉素注射液,预防感染。假手术组只做肾包膜剥离术。 4、一周后,在脊柱右侧中1/3旁开2-3cm纵行切口(切口略高于左侧),分离肌层,游离肾脏,无损伤血管钳夹住肾蒂,4号丝线结扎肾蒂,切除右侧肾脏,观察有无出血,缝合肌层和皮肤,酒精消毒手术切口。假手术组只做肾包膜剥离术。二、大鼠血、尿的留取及处理 1、术后第10周,将大鼠放于代谢笼中,留取24小时尿。 2、大鼠腹主动脉采血：腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,俯卧位定于鼠台上,用10ml注射器腹主动脉采血,常温3000rpm离心15min 三、大鼠腹腔巨噬细胞的提取 1、乙醚麻醉大鼠致死：术后第十周,将大鼠放入一密闭容器内,倒入2-3ml乙醚,麻醉4-5分钟后,取出大鼠。 2、酒精消毒大鼠：将大鼠放入装有75%酒精的烧杯中,浸泡消毒5分钟。 3、腹腔注射冰基础培养基诱导巨噬细胞产生：用10ml注射剂抽冰基础培养基注入大鼠腹腔,后轻柔大鼠腹部2-3分钟,再静置大鼠8分钟。 4、腹腔巨噬细胞的提取：将大鼠剖腹,用lml移液枪抽取大鼠腹腔液体,800rpm5min离心。四、巨噬细胞线粒体DNA拷贝数的检测提取Sham组和CRF组大鼠腹腔巨噬细胞,按照相关DNA提取试剂盒说明提取DNA,再通过标准曲线法PCR检测线粒体DNA拷贝数。五、Sham组和CRF组大鼠腹腔巨噬细胞线粒体数量的测定流式细胞术检测巨噬细胞线粒体数量。用PBS清洗巨噬细胞两遍,后用线粒体染色示踪剂MitoTracker Green FM100nM在37℃孵箱孵育30分钟,用含1%胎牛血清的PBS悬浮细胞,然后上流式细胞仪检测,后用相关软件分析数据。六、Real-time PCR及Western blotting检测Sham组和CRF组大鼠腹腔巨噬细胞线粒体结构蛋白如：细胞色素C、细胞色素C氧化酶及ATP合酶,且Real-time PCR检测巨噬细胞线粒体再生转录因子如：NRF1、NRF2及TFAM mRNA的表达将提取Sham组和CRF组大鼠腹腔巨噬细胞种入直径为6.5cm的培养皿,贴壁2小时后,倒掉培养基,用冰PBS洗2遍后,加入700mlTRIZOL,提取RNA,逆转录,Real-time PCR法检测细胞色素C、细胞色素C氧化酶及ATP合酶、NRF1、NRF2及TFAM mRNA的表达。将提取Sham组和CRF组大鼠腹腔巨噬细胞种入直径为6.5cm的培养皿,贴壁2小时后,倒掉培养基,用冰PBS洗2遍后,加入200ul裂解液,冰上孵育15分钟后,用细胞刮将细胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min离心,加入5×SDS上样缓冲液,100℃煮沸蛋白5min。Western blotting法检测细胞色素C、细胞色素C氧化酶的表达。七、Sham组和CRF组大鼠腹腔巨噬细胞再生相关通路蛋白如：P-AMPK/AMPK的检测将提取Sham组和CRF组大鼠腹腔巨噬细胞种入直径为6.5cm的培养皿,贴壁2小时后,倒掉培养基,用冰PBS洗2遍后,加入200ul裂解液,冰上孵育15分钟后,用细胞刮将细胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min离心,加入5×SDS上样缓冲液,100℃煮沸蛋白5min。Western blotting法检测AMPK活性。八、Sham组和CRF组大鼠腹腔巨噬细胞线粒体再生相关通路蛋白PGC1α活性检测免疫沉淀法检测PGC1α活性。提取Sham组和CRF组大鼠腹腔巨噬细胞蛋白,每组取400ug蛋白,用裂解液调整为500ul的总体积,每管样品中加入10ul的抗PGC1α及60ul的琼脂糖A/G珠,4℃摇床过夜。12000g,4℃离心5min,重复三次,弃去上清。样本蛋白与2×SDS上样缓冲液混匀,100℃水浴煮沸5min变性。Western blotting法检测PGC1α的活性。九、统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。与常数项比较,采用单样本t检验；两样本均数的比较采用两独立样本t检验。p0.05为差异有统计学意义。第二部分：尿毒症血清对大鼠腹腔巨噬细胞及人巨噬细胞THP-1线粒体再生的影响一、尿毒症血清及正常血清的制备 1、大鼠尿毒症血清采取Sham组大鼠血清及CRY组大鼠全血,40C3000rpm离心10min,抽取上层血清分装,—20℃保存备用。 2、人尿毒症血清采自本科住院未开始行血液透析及腹膜透析的患者,且年龄在18～45岁之间,病因为慢性肾炎,除外糖尿病、系统性红斑狼疮等继发性因素导致的尿毒症,正常人血清采自志愿者和本科住院患者(单纯血尿、无系统系疾病),要求年龄与尿毒症病人相仿。留取病人全血标本,4℃3000rpm10min,抽取上层血清分装,—20℃保存备用. 二、细胞培养 1、大鼠腹腔来源巨噬细胞的提取及培养将大鼠放入一密闭容器内,倒入2-3ml乙醚,麻醉4-5分钟后,取出大鼠。将大鼠放入装有75%酒精的烧杯中,浸泡消毒5分钟。用10ml注射剂抽冰基础培养基注入大鼠腹腔,后轻柔大鼠腹部2-3分钟,再静置大鼠8分钟。将大鼠剖腹,用1ml移液枪抽取大鼠腹腔液体。800rpm离心5min,吸掉上层1640,用含10%FBS的1640吹打混匀中皿在37℃,5%CO2孵箱中培养。 2、THP-1的培养 THP-1细胞复苏后在37℃,5%CO2,10%FBS的1640培养基中培养,传代。细胞状态良好时接种于培养皿,待细胞生长融合至80%后,加入20ng/ml的PMA孵育24小时,再加入不同浓度的尿毒症血清培养24小时后用于相关实验。三、不同浓度尿毒症血清对巨噬细胞线粒体DNA拷贝数的影响 1、不同浓度尿毒症血清对大鼠腹腔来源巨噬细胞线粒体DNA拷贝数的影响提取正常大鼠腹腔巨噬细胞,用0%、10%、20%的大鼠尿毒症血清分别刺激腹腔巨噬细胞24小时后,按照相关DNA提取试剂盒说明提取DNA,再通过标准曲线法PCR检测线粒体DNA拷贝数。 2、不同浓度尿毒症血清对THP-1线粒体DNA拷贝数的影响待THP-1达到80%融合率的时候,加20ng/ml的PMA孵育24小时后,用0%、10%、20%的尿毒症血清刺激24小时后,按照相关DNA提取试剂盒说明提取DNA,再通过标准曲线法PCR检测线粒体拷贝数。四、不同浓度尿毒症血清对巨噬细胞线粒体数目的影响 1、不同浓度尿毒症血清对大鼠腹腔来源巨噬细胞线粒体数目的影响提取正常大鼠腹腔巨噬细胞,用0%、10%、20%的大鼠尿毒症血清分别刺激腹腔巨噬细胞24小时后,用PBS清洗巨噬细胞两遍,后用线粒体染色示踪剂MitoTracker Green FM100nM在37-C孵箱孵育30分钟,用含1%胎牛血清的PBS悬浮细胞,然后上流式细胞仪检测,后用相关软件分析数据流式检测线粒体数目。 2、不同浓度尿毒症血清对THP-1线粒体DNA拷贝数的影响待THP-1达到80%融合率的时候,加20ng/ml的PMA孵育24小时后,用0%、10%、20%的尿毒症血清刺激24小时后,流式细胞术检测巨噬细胞线粒体数量。用PBS清洗巨噬细胞两遍,后用线粒体染色示踪剂MitoTracker Green FM100nM在37℃孵箱孵育30分钟,用含1%胎牛血清的PBS悬浮细胞,然后上流式细胞仪检测,后用相关软件分析数据。五、不同浓度尿毒症血清对巨噬细胞线粒体结构蛋白及线粒体再生相关转录因子mRNA的影响 1、不同浓度尿毒症血清对大鼠腹腔来源巨噬细胞线粒体结构蛋白及再生相关转录因子mRNA的影响提取正常大鼠腹腔巨噬细胞,用0%、10%、20%的大鼠尿毒症血清分别刺激腹腔巨噬细胞24小时后,加入700mlTRIZOL,提取RNA,逆转录,real-timePCR检测线粒体结构蛋白的mRNA表达。如：细胞色素C、细胞色素C氧化酶及ATP合酶,和巨噬细胞线粒体再生转录因子如：NRF1、NRF2及TFAM mRNA的表达。 2、不同浓度尿毒症血清对THP-1线粒体结构蛋白及再生相关转录因子mRNA的影响待THP-1达到80%融合率的时候,加20ng/ml的PMA孵育24小时后,用0%、10%、20%的尿毒症血清刺激24小时后,加入700mlTRIZOL,提取RNA,逆转录,eal-timePCR检测线粒体结构蛋白的mRNA表达。如：细胞色素C、细胞色素C氧化酶及ATP合酶,和巨噬细胞线粒体再生转录因子如：NRF1、NRF2及TFAM mRNA的表达。六、不同浓度尿毒症血清对巨噬细胞线粒体结构蛋白和线粒体再生相关通路蛋白的影响 1、不同浓度尿毒症血清对大鼠腹腔来源巨噬细胞线粒体结构蛋白和线粒体再生相关通路蛋白的影响提取正常大鼠腹腔巨噬细胞,用0%、10%、20%的大鼠尿毒症血清分别刺激腹腔巨噬细胞24小时后,倒掉培养基,用冰PBS洗2遍后,加入200ul裂解液,冰上孵育15分钟后,用细胞刮将细胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min离心,加入5×SDS上样缓冲液,100℃煮沸蛋白5min。 Western blotting法检测细胞色素C、细胞色素C氧化酶、P-AMPK/AMPK活性。 2、不同浓度尿毒症血清对THP-1线粒体结构蛋白和线粒体再生相关通路蛋白的影响待THP-1达到80%融合率的时候,加20ng/ml的PMA孵育24小时后,用0%、10%、20%的尿毒症血清刺激24小时后,倒掉培养基,用冰PBS洗2遍后,加入200ul裂解液,冰上孵育15分钟后,用细胞刮将细胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min离心,加入5×SDS上样缓冲液,100℃煮沸蛋白5min。 Western blotting法检测细胞色素C、细胞色素C氧化酶、P-AMPK/AMPK活性。七、统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。与常数项比较,采用单样本t检验；方差齐的多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法；方差不齐的多个样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett's T3法。p0.05为差异有统计学意义。第三部分：AMPK活化对尿毒症血清抑制线粒体再生的干预作用一、AICAR对尿毒症血清抑制线粒体DNA拷贝数影响提取正常大鼠腹腔巨噬细胞分别种入四个中皿,贴壁2小时后,用1mM的AICAR刺激其中一皿腹腔巨噬细胞12小时后换液(其余用正常胎牛血清培养),用大鼠尿毒症血清刺激24小时,与此同时其余三皿分别用正常血清及尿毒症血清刺激24小时。24小时后,按照相关DNA提取试剂盒说明提取DNA,再通过标准曲线法PCR检测线粒体DNA拷贝数。二、AICAR对尿毒症血清抑制线粒体数量的影响提取正常大鼠腹腔巨噬细胞分别种入四个中皿,贴壁2小时后,用1mM的AICAR刺激其中一皿腹腔巨噬细胞12小时后换液(其余用正常胎牛血清培养),用大鼠尿毒症血清刺激24小时,与此同时其余三皿分别用正常血清及尿毒症血清刺激24小时。24小时后,用PBS清洗巨噬细胞两遍,后用线粒体染色示踪剂MitoTracker Green FM100nM在37℃孵箱孵育30分钟,用含1%胎牛血清的PBS悬浮细胞,然后上流式细胞仪检测,后用相关软件分析数据流式检测线粒体数目。三、AICAR对尿毒症血清抑制线粒体结构蛋白如细胞色素C及细胞色素C氧化酶,和巨噬细胞线粒体再生相关通路蛋白如：P-AMPK/AMPK的检测。提取正常大鼠腹腔巨噬细胞分别种入四个中皿,贴壁2小时后,用1mM的AICAR刺激其中一皿腹腔巨噬细胞12小时后换液(其余用正常胎牛血清培养),用大鼠尿毒症血清刺激24小时,与此同时其余三皿分别用正常血清及尿毒症血清刺激24小时。用细胞刮将细胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min离心,加入5xSDS上样缓冲液,100℃煮沸蛋白5min。 Western blotting法检测细胞色素C、细胞色素C氧化酶、P-AMPK/AMPK活性。四、AC-AMPK上调AMPK对尿毒症血清抑制线粒体DNA拷贝数影响提取正常大鼠腹腔巨噬细胞分别种入四个中皿,贴壁生长24小时后,A皿加入携带有AMPK基因的腺病毒,B皿加入阴性对照病毒,C、D两皿用含10%的胎牛血清培养基培养24小时后,A、B、C皿加入大鼠尿毒症血清、D皿加入正常大鼠血清刺激24小时。按照相关DNA提取试剂盒说明提取DNA,再通过标准曲线法PCR检测线粒体DNA拷贝数。五、AC-AMPK上调AMPK对尿毒症血清抑制线粒体数量影响提取正常大鼠腹腔巨噬细胞分别种入四个中皿,贴壁生长24小时后,A皿加入携带有AMPK基因的腺病毒,B皿加入阴性对照病毒,C、D两皿用含10%的胎牛血清培养基培养24小时后,A、B、C皿加入大鼠尿毒症血清、D皿加入正常大鼠血清刺激24小时。24小时后,用PBS清洗巨噬细胞两遍,后用线粒体染色示踪剂MitoTracker Green FM100nM在37-C孵箱孵育30分钟,用含1%胎牛血清的PBS悬浮细胞,然后上流式细胞仪检测,后用相关软件分析数据流式检测线粒体数目。六、AC-AMPK上调AMPK对尿毒症血清抑制线粒体结构蛋白如细胞色素C及细胞色素C氧化酶,和巨噬细胞线粒体再生相关通路蛋白如：P-AMPK/AMPK的检测。提取正常大鼠腹腔巨噬细胞分别种入四个中皿,贴壁生长24小时后,A皿加入携带有AMPK基因的腺病毒,B皿加入阴性对照病毒,C D两皿用含10%的胎牛血清培养基培养24小时后,A、B、C皿加入大鼠尿毒症血清、D皿加入正常大鼠血清刺激24小时。用细胞刮将细胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min离心,加入5xSDS上样缓冲液,100℃煮沸蛋白5min。Western blotting法检测细胞色素C、细胞色素C氧化酶、P-AMPK/AMPK活性。七、统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。与常数项比较,采用单样本t检验；方差齐的多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法；方差不齐的多个样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett's T3法。p0.05为差异有统计学意义。结果第一部分：5/6肾切大鼠腹腔来源巨噬细胞相关实验一、肾衰大鼠模型的确立在二步法5/6肾切除术后的第10周,采集大鼠尿液和血液测定血肌酐和肌酐清除率。在第10周时,肾衰组大鼠体重、血肌酐及尿素氮与假手术组相比显著减少(p0.05)。二、慢性肾衰对巨噬细胞线粒体DNA拷贝数的影响慢性肾衰抑制巨噬细胞线粒体DNA的拷贝数,CRF组的线粒体DNA拷贝数与假手术组相比显著性下降(p0.05)。三、慢性肾衰对巨噬细胞线粒体数量的影响慢性肾衰抑制巨噬细胞线粒体数量,CRF组的线粒体数量与假手术组相比显著性下降(P0.05) 四、慢性肾衰对巨噬细胞线粒体结构蛋白影响 1、慢性肾衰巨噬细胞线粒体结构蛋白mRNA的表达情况CRF组结构蛋白与假手术组比减弱：细胞色素C、细胞色素C氧化酶及ATP合酶(p0.05)。 2、慢性肾衰巨噬细胞线粒体结构蛋白表达情况 CRF组结构蛋白与假手术相比减弱：细胞色素C细胞色素C氧化酶(p0.05)。五、慢性肾衰对巨噬细胞线粒体线粒体再生相关转录因子的影响 CRF组巨噬细胞线粒体再生转录因子mRNA与假手术比减弱：NRF1、NRF2及TFAMmRNA的表达(p0.05)。六、慢性肾衰大鼠巨噬细胞AMPK活化情况 CRF组大鼠腹腔巨噬细胞的P-AMPK与假手术组相比减弱(P0.05),AMPK总蛋白无变化。七、慢性肾衰大鼠巨噬细胞PGC1α活化情况 CRF组大鼠腹腔巨噬细胞的AC-PGC1α与假手术组相比增强(P0.05),PGC1α,总蛋白无变化。结论：在慢性肾功能不全状态下,线粒体再生功能障碍第二部分：尿毒症血清对腹腔巨噬细胞及THP-1细胞线粒体再生的影响一、尿毒症血清对巨噬细胞线粒体DNA拷贝数的测定 1、大鼠尿毒症血清对巨噬细胞线粒体DNA拷贝数的影响情况用0%、10%、20%大鼠尿毒症血清刺激大鼠腹腔来源巨噬细胞24小时后,随尿毒症血清浓度的增加,线粒体DNA拷贝数是逐渐下降的(P0.05)。 2、人尿毒症血清对巨噬细胞线粒体DNA拷贝数的影响情况用0%、10%、20%人尿毒症血清刺激人THP-1巨噬细胞24小时,随着浓度的增加,线粒体DNA拷贝数是逐渐下降的(P0.05)。二、尿毒症血清对巨噬细胞线粒体数量的影响 1、大鼠尿毒症血清对巨噬细胞线粒体数量的影响情况用0%、10%、20%大鼠尿毒症血清刺激大鼠腹腔来源巨噬细胞24小时后,随尿毒症血清浓度的增加,线粒体数量是逐渐下降的(P0.05)。 2、人尿毒症血清对巨噬细胞线粒体数数量的影响情况用0%、10%、20%人尿毒症血清刺激人THP-1巨噬细胞24小时,随着浓度的增加,线粒体数量是逐渐下降的(P0.05)。三、尿毒症血清对巨噬细胞线粒体结构蛋白的影响 1、大鼠尿毒症血清对大鼠腹腔来源巨噬细胞线粒体结构蛋白影响 1.1用0%、10%、20%大鼠尿毒症血清刺激大鼠腹腔来源巨噬细胞24小时,随着浓度的增加,线粒体结构蛋白的表达逐渐下降(P0.05)。 1.2用0%、10%、20%大鼠尿毒症血清刺激大鼠腹腔来源巨噬细胞24小时,随着浓度的增加,线粒体结构蛋白的mRNA的表达逐渐下降((P0.05) 2、人尿毒症血清对THP-1巨噬细胞线粒体结构蛋白的影响 2.1用0%、10%、20%人尿毒症血清刺激人THP-1巨噬细胞24小时,随着浓度的增加,线粒体结构蛋白的表达逐渐下降(P0.05)。 2.2用0%、10%、20%人尿毒症血清刺激人THP-1巨噬细胞24小时,随着浓度的增加,线粒体结构蛋白mRNA的表达逐渐下降(P0.05)。四、尿毒症血清对巨噬细胞线粒体再生相关转录因子的影响 1、大鼠尿毒症血清对大鼠腹腔来源巨噬细胞线粒体再生相关转录因子影响用0%、10%、20%大鼠尿毒症血清刺激大鼠腹腔来源巨噬细胞24小时,随着浓度的增加,线粒体再生相关转录因子mRNA的表达逐渐下降(P0.05)。 2、人尿毒症血清对THP-1细胞线粒体再生相关转录因子的影响用0%、10%、20%人尿毒症血清刺激人THP-1巨噬细胞24小时,随着浓度的增加,线粒体再生相关转录因子mRNA的表达逐渐下降(P0.05)。五、尿毒症血清对巨噬细胞AMPK活性的影响 1、大鼠尿毒症血清对大鼠腹腔来源巨噬细胞AMPK活性的影响用0%、10%、20%人尿毒症血清刺激大鼠腹腔巨噬细胞24小时,随着浓度的增加,P-AMPK的表达逐渐下降(P0.05), AMPK总蛋白表达不变。 2、人尿毒症血清对THP-1细胞AMPK的影响用0%、10%、20%人尿毒症血清刺激人THP-1巨噬细胞24小时,随着浓度的增加,P-AMPK的表达逐渐下降(P0.05), AMPK总蛋白表达不变。结论：在体外用尿毒症血清刺激原代大鼠巨噬细胞和人THP-1巨噬细胞时,其线粒体再生也是受抑制的。进一步表明在慢性肾功能不全的情况下,巨噬细胞线粒体再生障碍。第三部分：AMPK活化对尿毒症血清抑制线粒体再生的干预作用一、AMPK活化对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体DNA拷贝数的影响 1、AICAR对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体DNA拷贝数影响用lmM的AICAR与大鼠腹腔来源巨噬细胞共同孵育4小时之后,加入20%的大鼠尿毒症血清孵育24小时,AICAR对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体DNA拷贝数有上调(P0.05)。 2、携带有AMPK基因的腺病毒对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体DNA拷贝数的影响。用携带有AMPK基因的腺病毒转染正常大鼠腹腔来源的巨噬细胞24小时后,再用20%的尿毒症血清与之共同孵育24小时,受携带AMPK基因病毒转染后巨噬细胞组线粒体DNA拷贝数上调(P0.05)。二、AMPK活化对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体数量的影响 1、AICAR对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体数量的影响用1mM的AICAR与大鼠腹腔来源巨噬细胞共同孵育4小时之后,加入20%的大鼠尿毒症血清孵育24小时,AICAR对尿毒症血清刺激组巨噬细胞数量有上调(P0.05)。 2、携带有AMPK基因的腺病毒对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体数量的影响。用携带有AMPK基因的腺病毒转染正常大鼠腹腔来源的巨噬细胞24小时后,再用20%的尿毒症血清与之共同孵育24小时,受携带AMPK基因病毒转染后巨噬细胞组线粒体数量上调(P0.05) 三、AMPK活化对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体结构蛋白的影响 1、AICAR对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体结构蛋白的影响用1mM的AICAR与大鼠腹腔来源巨噬细胞共同孵育4小时之后,加入20%的大鼠尿毒症血清孵育24小时,AICAR对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体结构蛋白有上调(P0.05)。 2、携带有AMPK基因的腺病毒对尿毒症血清刺激组巨噬细胞线粒体结构蛋白的影响。用携带有AMPK基因腺病毒转染正常大鼠腹腔来源巨噬细胞24小时后,再用20%尿毒症血清与之共同孵育24小时,受携带AMPK基因病毒转染后巨噬细胞组线粒体结构蛋白上调(P0.05)。四、AMPK活化对尿毒症血清刺激组巨噬细胞AMPK活性的影响 1、AICAR对尿毒症血清刺激组巨噬细胞AMPK活性的影响用1mM的AICAR与大鼠腹腔来源巨噬细胞共同孵育4小时之后,加入20%的大鼠尿毒症血清孵育24小时,AICAR对尿毒症血清刺激组巨噬细胞AMPK活性增强(P0.05)。 2、携带有AMPK基因的腺病毒对尿毒症血清刺激组巨噬细胞AMPK活性的影响。用携带有AMPK基因的腺病毒转染正常大鼠腹腔来源的巨噬细胞24小时后,再用20%的尿毒症血清与之共同孵育24小时,受携带AMPK基因病毒转染后巨噬细胞组活性增强(P0.05)。结论：当上调AMPK时,尿毒症血清对巨噬细胞线粒体再生的抑制作用被削弱。AMPK、PGC1α是调控巨噬细胞线粒体再生的重要的调控因子。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692

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