姜黄素通过调节小凹蛋白1对糖尿病肾病足细胞的保护作用

发布时间：2018-08-28 18:34

【摘要】：研究背景与研究目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是终末期肾脏病的一个主要病因,其发病率及病死率逐年增加。即使经过严格的血糖和血压控制,仍有许多糖尿病病人出现DN的并发症。DN的发病机制非常复杂,至今仍未完全明了,因此探究DN的发病机制以及寻找早期可以防治DN的药物是十分有必要的。以前人们认为糖尿病肾病是一种非免疫性疾病,但现在很多研究表明固有免疫系统和炎症机制的激活在糖尿病肾病的发病机制及防治过程中起着非常重要的作用。近年来,关于Toll样受体在肾脏疾病发病机制中的作用受到广泛关注。Toll样受体是一种模式识别受体,能激活固有免疫系统,导致炎性细胞因子和化学因子的产生。已有研究发现在糖尿病状态下,Toll样受体能敏感的感知高糖等危险信号,随后介导炎症反应,促进疾病进展。许多研究表明,Toll样受体4(toll-like receptor4, TLR4)在肾小球肾炎、肾脏缺血再灌注、DN等很多肾脏疾病中起着重要的作用。足细胞是一种具有高度分化的肾小球血管上皮细胞,参与形成肾小球滤过屏障。研究表明足细胞损伤导致肾小球的滤过屏障受损,形成大量蛋白尿,最终导致肾小球硬化。许多实验和临床研究均证实DN中存在足细胞密度减少、足细胞受损,足细胞受损情况成为预测DN进展的主要指标之一。在很多损伤因素的刺激下足细胞可以发生一连串的适应性改变。但如果这种损伤因素变为慢性进展性的刺激,足细胞除了发生凋亡还会导致上皮间质转分化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)。EMT使足细胞表型发生改变,使其上皮特异性指标丢失,而增加其间质表型的指标。近年来,有研究指出足细胞上皮间质转分化可能参与DN的发生发展。小凹蛋白1 (caveolin-1, cav-1)是小凹(caveolae)的主要结构和功能成分,保持caveolae的Ω形态,存在于多种细胞膜。Caveolae能为许多信号分子之间的相互作用提供了作用的平台,也可以调节多个信号通路的活性。P-cav-1在特异性刺激状态下可与其他蛋白相互作用而发挥其功能。近年来许多研究证实了cav-1在调节固有免疫和炎症反应中具有重要作用。有报道cav-1通过直接与TLR4结合发挥其抗炎效果,还有研究发现p-cav-1可激活TLR4信号通路介导的炎症反应。然而,cav-1或者p-cav-1是否会影响足细胞中TLR4激活目前还没有研究。许多研究还发现cav-1可以与上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)结合在一起,并与p-链蛋白(β-catenin)相互作用。Cav-1可参与调节细胞间的连接功能,而cav-1与β-catenin的相互作用成为DN足细胞发生的EMT改变的新的机制。姜黄素是调味品姜黄的主要组成成分,具有广泛的生物活性和药理作用,如抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗增殖等,为许多疾病提供有效的治疗方法。但是姜黄素抑制或延缓糖尿病相关的肾脏炎症反应和足细胞EMT的分子机制仍不明确。依据以上背景,我们提出如下假说：糖尿病大鼠肾脏中cav-1或p-cav-1的改变可激活TLR4,引发一系列的炎症反应,而姜黄素治疗可以通过抑制cav-1或p-cav-1与TLR4的相互作用,抑制由糖尿病引发的炎症反应；姜黄素通过调节cav-1与β-catenin的交叉对话抑制糖尿病条件下足细胞的EMT,从而抑制肾脏纤维化进展。为验证我们的假设,我们将首先检测糖尿病大鼠肾脏中的炎症因子、EMT、cav-1或p-cav-1的变化、TLR4以及β-catenin的变化,验证其在体内存在上述改变,然后利用体外高糖刺激的足细胞模型寻找上述指标变化的机制。研究方法为明确姜黄素对糖尿病大鼠肾组织中炎症反应的抑制作用及其机制,体内实验采用链脲佐菌素(streptozoticin, STZ)一次性腹腔内注射使糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠成模,STZ注射后给予姜黄素100mg-kg-1·d-1灌胃。治疗12周后,称重、抽血、留尿、取肾,进而检测各个指标。体外实验小鼠永生化足细胞系给予姜黄素(1,5,10μ.M)预刺激1h后,给予高糖刺激72h。实验室方法检测大鼠空腹血糖、24h尿蛋白定量、肾重/体重和内生肌酐清除率；PAS、masson染色以及FN、Collagen Ⅰ的免疫组织化学染色评估大鼠肾小球纤维化情况；采用免疫组织化学染色检测大鼠肾脏中ED-1、MCP-1、TLR4的表达；用ELISA法检测肾组织和足细胞中IL-6、TNFα的蛋白表达水平；实时荧光定量RT-PCR检测肾脏和足细胞中IL-6、TNFα、IL-1p和TLR4的基因表达水平；western blot方法检测大鼠肾脏组织和足细胞中p-cav-1、cav-1、TLR4的蛋白表达。为了验证TLR4与炎症因子之间的关系,我们引进TLR4 siRNA转染进足细胞,实时荧.光定量RT-PCR和ELISA法分别检测高糖刺激的足细胞中IL-6、TNFa的表达水平。为了进一步研究p-cav-1的作用,我们引进cav-1 Tyr14磷酸化位点突变的质粒转染进足细胞,western blot方法检测足细胞中p-cav-1、cav-1、TLR4的表达,并用ELISA法检测足细胞中IL-6、TNFα的蛋白表达水平。为明确姜黄素对糖尿病大鼠肾脏足细胞EMT的作用和机制研究,体内实验采用STZ一次性腹腔注射使糖尿病大鼠成模,STZ注射后给予姜黄素100mg·kg-1·d-1灌胃。治疗12周后,称重、抽血、留尿、取肾,进而检测各个指标。体外实验小鼠永生化足细胞系给予姜黄素(1,5,10μm)预刺激1h后,给予高糖刺激72h。实验室方法检测大鼠空腹血糖、24h尿蛋白定量、肾重/体重和内生肌酐清除率；PAS、masson染色方法评估大鼠肾小球的纤维化情况；电镜检测足细胞足突的融合情况；western blot、免疫组织化学染色和实时荧光定量RT-PCR方法检测大鼠肾脏组织或足细胞中FSP-1、a-SMA、P-cadherin、synaptopodin的蛋白和基因表达；western blot、免疫组织化学染色方法检测大鼠肾脏组织或足细胞中p-cav-1、cav-1、ictive β-catenin、β-catenin的表达。采用免疫共沉淀方法检测cav-1与β-catenin之间相互作用；采用免疫荧光技术检测cav-1与β-catenin之间的定位改变。研究结果1.姜黄素通过抑制p-cav-1诱导的TLR4激活而抑制糖尿病大鼠肾脏的炎症反应1.1姜黄素改善糖尿病大鼠代谢指标较DM组相比,姜黄素治疗后空腹血糖无明显改善,24h尿蛋白定量以及肾重/体重均明显下降,内生肌酐清除率明显增加。1.2姜黄素改善肾小球纤维化等肾脏病理的异常PAS染色显示姜黄素治疗组大鼠肾脏系膜区细胞外基质的沉积较DM组明显减少。Masson染色显示糖尿病大鼠肾脏纤维化明显,而姜黄素治疗明显改善肾脏纤维化程度。免疫组织化学的染色结果表明姜黄素治疗组大鼠肾组织中FN和Collagen I的蛋白表达较DM组明显减少。1.3姜黄素对糖尿病大鼠肾脏巨噬细胞的浸润及MCP-1表达的影响DM组大鼠肾脏中ED-1(ED-1表示巨噬细胞)的浸润较正常对照组明显增加,但姜黄素治疗后明显减少。免疫组织化学染色结果示姜黄素干预糖尿病大鼠后其肾组织中MCP-1的表达较DM组明显减少。1.4姜黄素抑制糖尿病大鼠肾组织中炎症因子的表达实时荧光定量RT-PCR检测结果发现姜黄素治疗组大鼠肾脏组织中IL-6、TNFα、IL-1β的基因表达较DM组明显下降。ELISA检测结果显示姜黄素治疗组大鼠肾脏组织中IL-6和TNFa的蛋白表达较DM组明显地下降。1.5姜黄素治疗糖尿病大鼠肾脏中cav-1与TLR4的变化免疫组织化学染色、实时荧光定量RT-PCR和western blot均发现较正常对照组,糖尿病组大鼠肾组织中TLR4表达明显升高,而姜黄素治疗后明显减少大鼠肾脏中TLR4的表达。同时western blot结果显示姜黄素治疗组大鼠肾脏中p-cav-1的表达较DM组明显地下降。1.6姜黄素减少高糖刺激的足细胞中炎症因子的表达实时荧光定量RT-PCR检测结果发现姜黄素治疗组足细胞中1L-6、TNFα、IL-1p的基因表达较HG组明显下降。ELISA检测结果显示姜黄素治疗组足细胞中IL-6和TNFα的蛋白表达较HG组明显下降。单纯姜黄素和渗透压并不影响炎症因子的表达。1.7 TLR4对高糖刺激的足细胞中炎症因子表达的作用TLR4 siRNA转染后使足细胞内源性TLR4的蛋白表达减少60%,基因水平减少72%。单纯TLR4 siRNA转染足细胞,对内源性IL-6、TNFα的蛋白和基因表达均无明显影响,但可明显减少高糖诱导的IL-6和TNFα的升高。1.8姜黄素通过调节p-cav-1抑制高糖诱导的足细胞中TLR4的激活与正常组比较,在高糖状态下TLR4的表达明显增加,同时高糖能明显诱导cav-1 Tyr14位点的磷酸化。而姜黄素(1,5,10μM)预刺激能明显减少高糖诱导的TLR4和p-cav-1的增加。较空质粒组,GFP-cav-1 Y14F明显减少高糖诱导的足细胞中p-cav-1TLR4、IL-6、TNF-α的蛋白表达。2.姜黄素通过调控cav-1改善糖尿病大鼠肾脏足细胞上皮间质转分化2.1姜黄素改善糖尿病大鼠代谢指标和肾脏病理较DM组相比,姜黄素治疗后空腹血糖无明显改善,24h尿蛋白定量以及肾重/体重均明显下降,内生肌酐清除率明显地上升。PAS染色显示姜黄素治疗组大鼠肾脏系膜区细胞外基质沉积较DM组明显减少。Masson染色显示糖尿病大鼠肾脏纤维化明显,而姜黄素治疗明显改善肾脏纤维化程度。电镜结果显示与正常对照组比较,DM组大鼠肾脏基底膜增厚,足突出现融合,而姜黄素治疗后可明显改善DM组大鼠肾脏的这些形态学的损伤。2.2姜黄素改善DM大鼠肾脏EMT指标免疫组化、Western blot和RT-PCR均发现较正常对照组,DM组P-cadherin, synaptopodin的蛋白和基因表达均明显下降,FSP、α-SMA、snail1的表达明显增加,而姜黄素治疗后均能改善上述指标的变化。2.3姜黄素对糖尿病大鼠肾脏p-cav-1指标的影响Western blot结果显示较正常对照组,DM组p-cav-1、active β-catenin、 P-catenin水平明显增加。免疫组织化学染色显示cav-1的表达在各组间无明显差异,而P-catenin在DM组大鼠肾脏中的表达要高于正常组。姜黄素治疗12周后,与正常组大鼠比较,DM组大鼠肾脏中p-cav-1、active β-catenin、β-catenin的表达明显减少。2.4高糖诱导足细胞EMT及姜黄素抑制足细胞EMT作用Western blot和实时荧光定量RT-PCR结果均显示P-cadherin和synaptopodin较对照组以时间依赖性地减少,而FSP-1、α-SMA较对照组以时间依赖性地增加。姜黄素(1,5,10μM)干预明显抑制高糖诱导的P-cadherin、synaptopodin、FSP-1和α-SMA的蛋白和基因改变。2.5姜黄素通过调节p-cav-1和增加cav-1和β-catenin的稳固联系而抑制高糖诱导的足细胞EMT与对照组比较,高糖明显增加足细胞中p-cav-1、active β-catenin、β-catenin的表达,而姜黄素(1,5,10μM)预刺激明显改善高糖诱导的上述指标的变化。免疫共沉淀结果显示高糖刺激72h后,cav-1和β-catenin免疫共沉淀明显减少,而姜黄素(10μM)干预后cav-1和β-catenin免疫共沉淀增加。荧光显微镜观察到高糖使cav-1和β-catenin在细胞膜的共定位减少,而姜黄素干预后使cav-1和β-catenin在细胞膜的共定位明显增加。结论1.姜黄素预处理可以减轻STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏病理损伤,保护足细胞,减少尿蛋白,改善肾功能,延缓DN的进展。2.姜黄素可改善STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏和高糖刺激的足细胞中炎症反应和EMT改变,减少糖尿病大鼠肾脏中巨噬细胞的浸润及肾小球的纤维化。3.姜黄素改善STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏和高糖刺激的足细胞中炎症反应的作用与抑制TLR4的激活有关。高糖可诱导足细胞中cav-1的磷酸化及TLR4的表达增加。姜黄素可能通过抑制p-cav-1诱导的TLR4的激活来发挥抗炎效果,抑制巨噬细胞浸润,下调炎症因子的表达。4.姜黄素防治DN的作用机制还与抑制足细胞EMT有关。高糖刺激以时间依赖地促进足细胞EMT的发生,而姜黄素可以剂量依赖的减轻足细胞EMT。姜黄素可能是通过减少高糖诱导的p-cav-1的产生及增加cav-1与β-catenin的稳定性来抑制高糖诱导的足细胞EMT。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
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本文编号：2210249