Exendin-4对高糖刺激下大鼠肾小球系膜细胞自噬的影响及机制

发布时间：2018-09-13 12:21

【摘要】：[背景] 糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)常见且严重的慢性并发症之一,其患病率日益增加。流行病学调查显示,DN已成为终末期肾病的主要病因,严重威胁人类健康。DN的发病机制复杂,至今尚未明确,而目前的治疗手段仅能延缓却未能阻断DN进展。因此,探索DN的发病机制,寻找新的治疗靶点,已成为当今医学领域研究的热点与难点。肾小球系膜细胞(Mesangial cells, MCs)是肾脏重要的固有细胞之一,具有维持肾小球系膜区细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)代谢平衡的重要作用。ECM合成与降解的平衡对维护组织器官稳态至关重要。在DN的发病机制中,葡萄糖毒性引起MCs功能障碍,ECM合成与降解失衡,胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等ECM成分在肾小球系膜区蓄积,最终导致肾小球系膜区扩张和肾小球硬化等DN主要的病理学改变。 Ⅰ型胶原蛋白(Collagen I, Col-Ⅰ)是由MCs合成并分泌的一种主要的系膜ECM成分,也是DN晚期肾小球硬化的标志产物。既往国外研究发现高糖诱导MCs高表达并分泌Col-Ⅰ,与此同时Col-Ⅰ还能反作用于MCs,引起多种蛋白表达的变化及细胞凋亡。研究认为高糖通过激活转化生长因子-(?)1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)等促进MCs合成Col-Ⅰ;高糖还能通过抑制基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)降低MCs对系膜基质中Col-Ⅰ的降解。最近国外研究发现另一种不同于MMPs的Col-Ⅰ降解途径。自噬是广泛存在于真核细胞中的一种依赖溶酶体降解异常细胞质成分或受损细胞器的细胞内降解途径,对维护细胞内稳态具有重要作用。目前大量研究证实自噬在多种生理、病理过程中的重要作用并与药物性肾损伤、缺血再灌注肾损伤、肾脏衰老等肾脏疾病密切相关,但是自噬在DN发生发展中的作用尚未明确。最近研究报道指出小鼠肺泡上皮细胞、大鼠心肌成纤维细胞等细胞能通过自噬降解Col-Ⅰ,可见自噬具有一定的抵抗组织器官纤维化的作用。还有研究发现,DM患者和DM小鼠肾脏组织中的自噬水平明显降低,高糖培养的小鼠足细胞的自噬水平也明显降低。但是,自噬在葡萄糖毒性损伤MCs中的变化和功能仍不清楚。因此,我们假设高糖损伤MCs的自噬功能,MCs自噬抑制可能参与了DN的发生与发展,这可能是因为自噬具有细胞内降解Col-Ⅰ、维护ECM代谢平衡的肾脏保护作用。胰高血糖素样肽(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)是一种由肠道L细胞分泌的促进胰岛素分泌的肽类激素。GLP-1与GLP-1受体(GLP-1receptor, GLP-1R)结合后,通过促进胰岛β细胞分泌胰岛素、抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素、抑制食欲、延缓胃排空等途径降低血糖。Exendin-4是从美国西南部巨蜥蜴唾液中分离所得的GLP-1类似物,已被研发为长效GLP-1受体激动剂艾塞那肽用于治疗2型糖尿病。研究发现Exendin-4除了降低血糖、保护胰岛β细胞的作用以外,还具有保护肾脏的作用。在调节ECM代谢方面,Exendin-4具有逆转高糖状态下ECM合成与降解失衡的作用。目前,Exendin-4发挥肾脏保护作用的具体机制尚未研究透彻。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是真核生物中高度保守的能量感受器,广泛表达于所有类型的肾脏细胞。AMPK还是调控细胞生长、凋亡、自噬等多种生命过程的重要激酶,其磷酸化活性降低与DN的发生发展关系密切。我们研究证实Exendin-4通过激活AMPK信号通路改善由高糖诱导的大鼠MCs功能障碍。还有研究发现GLP-1和Exendin-4分别通过提高胰岛β细胞、肝细胞的自噬水平抵抗葡萄糖、脂肪酸损伤细胞。但是,Exendin-4是否可以通过调节细胞自噬功能保护MCs、维护ECM代谢平衡,国内外均未见研究报道。因此,我们假设在高糖损伤MCs中,细胞自噬抑制与AMPK磷酸化活性降低有关；Exendin-4可能通过激活AMPK增强MCs自噬功能,减少高糖诱导的Col-Ⅰ蓄积。关于MCs自噬在高糖诱导Col-Ⅰ蓄积中的作用以及Exendin-4对高糖刺激下MCs自噬功能的影响,目前国内外暂无研究报道。研究并理解其中的细胞及分子机制,对于探索DN发病机制以及寻找新治疗靶点至关重要。因此,本课题以大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1作为研究对象,首先通过体外培养HBZY-1细胞观察高糖对HBZY-1细胞自噬功能及细胞内Col-Ⅰ含量的影响,然后利用自噬增强剂雷帕霉素探讨MCs自噬在高糖诱导Col-Ⅰ蓄积中的作用,最后研究Exendin-4对高糖刺激下MCs自噬功能的影响和机制,旨在为DN的防治提供理论依据并寻找新思路。本课题由以下两个章节的研究组成：第一章大鼠系膜细胞自噬在高糖诱导Ⅰ型胶原蛋白蓄积中的变化与作用 [目的] 1.观察高糖对大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1自噬功能的影响； 2.观察高糖对HBZY-1细胞内Col-Ⅰ含量的影响； 3.探讨自噬在高糖诱导HBZY-1细胞内Col-Ⅰ蓄积中的作用。 [方法] 1.细胞培养：采用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基,于37℃、5%C02培养箱内传代培养大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1. 2.实验分组：正常对照组(NG组,5.6mmol/L D-葡萄糖)、高渗对照组(Man组,5.6mmol/L D-葡萄糖+24.4mmol/LD-甘露醇)、高糖组(HG组,30mmol/LD-葡萄糖)、雷帕霉素组(NG+R组,5.6mmol/L D-葡萄糖+10nmol/L雷帕霉素)、高糖联合雷帕霉素处理组(HG+R组,30mmol/L D-葡萄糖+10nmol/L雷帕霉素)。 3.高糖条件培养HBZY-1细胞,分别于Oh、12h、24h、36h、48h、72h提取细胞全蛋白,应用免疫印迹法检测高糖刺激不同时间点后HBZY-1细胞内自噬体形成标志蛋白LC3-Ⅱ的表达或HBZY-1细胞内Col-Ⅰ的含量。 4.为了排除刺激时间与渗透压对HBZY-1细胞自噬的影响,分三组(NG组、Man组及HG组)培养HBZY-1细胞,以高糖条件下HBZY-1细胞LC3-Ⅱ蛋白表达差异最显著的时间点作为研究终点,提取三组细胞总RNA及全蛋白；应用实时荧光定量PCR法检测三组细胞自噬相关基因Atg5、Atg7mRNA的相对表达量(2-△△口计算法)；应用免疫印迹法检测三组细胞自噬相关蛋白LC3和Beclin-1、自噬降解底物SQSTM1/P62蛋白的表达,采用Quantity One4.5.2软件进行半定量分析,以管家基因编码的β-actin蛋白作为内参,计算目的蛋白的相对表达量。 5.为了排除刺激时间与渗透压对HBZY-1细胞内Col-Ⅰ含量的影响,分三组(NG组、Man组及HG组)培养HBZY-1细胞,以高糖条件下HBZY-1细胞Col-Ⅰ蛋白表达差异最显著的时间点作为研究终点,提取三组细胞全蛋白；应用免疫印迹法,以管家基因编码的β-actin蛋白作为内参,半定量分析三组细胞Col-Ⅰ的相对表达量。 6.分四组(NG组、NG+R组、HG组、HG+R组)培养HBZY-1细胞,以高糖条件下HBZY-1细胞LC3-Ⅱ和Col-Ⅰ表达均有显著差异的时间点作为研究终点,提取四组细胞全蛋白；应用免疫印迹法,以管家基因编码的β-actin蛋白作为内参,半定量分析四组细胞LC3-II和Col-Ⅰ的相对表达量。 7.统计学处理：实验数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析,各组计量资料采用均数±标准差(x±s)表示。多组均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),组间多重比较采用LSD法；若方差不齐时,采用Welch法近似方差分析进行校正,组间多重比较采用Dunnett's T3法。P0.05认为差异具有统计学意义。 [结果] 1.高糖环境下HBZY-1细胞自噬体形成标志蛋白LC3-Ⅱ的表达量随时间变化的特点：高糖刺激HBZY-1细胞36小时(HG36h)后,LC3-Ⅱ蛋白的表达量较HG Oh显著降低(P=0.018),并随着刺激时间延长逐渐降低(P0.01); HG72h HBZY-1细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达量最低,与HG36h比较差异具有统计学意义(P=0.038)。因此选用72小时作为研究高糖对HBZY-1细胞自噬功能影响的研究终点。 2.高糖对HBZY-1细胞自噬相关基因Atg5mRNA、Atg7mRNA表达的影响： HG组HBZY-1细胞Atg5mRNA的表达量显著降低,较NG组下调约3.5倍(P=0.022)；HG组HBZY-1细胞Atg7mRNA的表达量显著降低,较NG组下调约2.5倍(P=0.011)；NG组与Man组HBZY-1细胞自噬相关基因Atg5和Atg7的表达未见统计学差异(P0.05)。 3.高糖对HBZY-1细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和自噬降解底物SQSTM1/p62表达的影响： HG组HBZY-1细胞LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表达量均较NG组显著降低(P=0.019,P=0.012)；HG组HBZY-1细胞SQSTM1/p62蛋白的表达量较NG组显著增加(P=0.000)；NG组与Man组HBZY-1细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和自噬降解底物SQSTM1/p62的表达均未见统计学差异(P0.05)。 4.高糖环境下HBZY-1细胞内Col-Ⅰ含量随时间变化的特点：高糖刺激72小时(HG72h)后,HBZY-1细胞内Col-Ⅰ蛋白的含量较HG Oh显著增多(P=0.000)；其它时间点HBZY-1细胞内Col-Ⅰ蛋白的含量与HG Oh比较差异无统计学意义(P0.05)。因此选用72小时作为研究高糖对HBZY-1细胞内Col-Ⅰ含量影响的研究终点。 5.高糖对HBZY-1细胞内Col-Ⅰ含量的影响： HG组HBZY-1细胞内Col-Ⅰ的含量显著增高,是NG组的2倍(P=0.028)；NG组与Man组HBZY-1细胞内Col-Ⅰ的含量未见统计学差异(P0.05)。 6.自噬激动剂雷帕霉素对HBZY-1细胞内LC3-Ⅱ、Col-Ⅰ表达的影响：与NG组相比,高糖组HBZY-1细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达量显著降低(P=0.004),Col-I的含量显著增高(P=0.005)；与高糖组相比,给予雷帕霉素干预后(HG+R组)HBZY-1细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达量显著增高(P=0.039),Col-I的含量显著降低(P=0.049)。 [结论] 1.高糖抑制HBZY-1细胞自噬相关基因和蛋白的表达,其作用与渗透压无关；可见,在DM状态的肾脏中,葡萄糖毒性损伤了MCs的自噬功能。 2.高糖诱导HBZY-1细胞内Col-I蓄积,其作用与渗透压无关。 3.在高糖诱导HBZY-1细胞内Col-I蓄积中,自噬增强与Col-I减少有关。 4.MCs自噬可能参与降解高糖诱导产生的Col-I,减少Col-I蓄积,具有维护ECM代谢平衡的肾脏保护作用；高糖损伤MCs自噬功能则参与了DN发病和进展。第二章Exendin-4对高糖刺激下大鼠系膜细胞自噬的影响和机制 [目的] 1.观察不同浓度Exendin-4对高糖刺激下HBZY-1细胞自噬功能的影响； 2.观察高糖对AMPK磷酸化活性的影响及Exendin-4的干预作用； 3.探讨Exendin-4干预高糖抑制HBZY-1细胞自噬的可能机制。 [方法] 1.细胞培养：同第一章。 2.实验分组：高糖组(HG组,30mmol/L D-葡萄糖)、高糖联合lnmol/L Exendin-4组(HG+1nM Ex-4组,30mmol/L D-葡萄糖+1nmol/L Exendin-4).高糖联合10nmol/L Exendin-4组(HG+10nM Ex-4组,30mmol/L D-葡萄糖+10nmol/L Exendin-4).高糖联合100nmol/L Exendin-4组(HG+100nM Ex-4组,30mmol/L D-葡萄糖+100nmol/L Exendin-4).正常对照组(NG组,5.6mmol/LD-葡萄糖)、10nmol/L Exendin-4组(NG+10nM Ex-4组,5.6mmol/L D-葡萄糖+10nmol/L Exendin-4). 3.高糖、高糖联合不同浓度(1.10.100nmol/L)Exendin-4培养HBZY-1细胞,于72h提取各组细胞全蛋白,应用免疫印迹法半定量分析四组细胞LC3-Ⅱ蛋白的相对表达量。 4.分两组(HG组、HG+10nM Ex-4组)培养HBZY-1细胞,分别于Oh、24h、36h、48h、72h提取细胞全蛋白,应用免疫印迹法检测各组HBZY-1细胞总AMPK (t-AMPK)和磷酸化AMPK (p-AMPK)蛋白的相对表达量。 5.分四组(NG组、NG+10nM Ex-4组、HG组、HG+lOnM Ex-4组)培养HBZY-1细胞,以高糖条件下HBZY-1细胞AMPK磷酸化蛋白表达差异最显著的时间点作为研究终点,提取四组细胞全蛋白,应用免疫印迹法检测四组细胞t-AMPK和p-AMPK蛋白的相对表达量。采用p-AMPK/t-AMPK比值表示AMPK磷酸化活性的水平。 6.分四组(NG组、NG+10nM Ex-4组、HG组、HG+10nM Ex-4组)培养HBZY-1细胞,于72h提取四组细胞全蛋白,应用免疫印迹法检测四组细胞LC3-Ⅱ蛋白的相对表达量。 7.统计学处理：采用Spearman相关系数分析Exendin-4浓度与HBZY-1细胞LC3-Ⅱ蛋白表达量的关系,P0.05认为双变量存在相关关系。余同第一章。 [结果] 1.不同浓度Exendin-4对高糖刺激下HBZY-1细胞LC3-Ⅱ蛋白表达的影响：高糖联合不同浓度Exendin-4处理的HBZY-1细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达量均显著高于HG组(P=0.000)；与%HG+1nM Ex-4组相比,HG+10nM Ex-4组和HG+100nMEx-4组HBZY-1细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达量均显著增高(P=0.001); HG+10nMEx-4组与HG+100nM Ex-4组HBZY-1细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达量无统计学差异(P=0.674)。Spearman相关系数分析显示：高糖环境下,Exendin-4浓度与HBZY-1细胞LC3-Ⅱ蛋白表达量呈显著正相关关系(Spearman相关系数=0.91,P=0.000)。 2.高糖刺激下HBZY-1细胞磷酸化AMPK蛋白表达量随时间变化的特点及Exendin-4的干预作用：高糖刺激下,HBZY-1细胞p-AMPK蛋白的表达量降低,其中HG36h和HG48hHBZY-1细胞p-AMPK蛋白表达量降低最明显；给予10nmol/L Exendin-4干预后,高糖刺激的各时间点HBZY-1细胞p-AMPK蛋白的表达量相近并高于同时间点高糖组的表达量。 3.Exendin-4对HBZY-1细胞AMPK磷酸化活性的影响： HG组HBZY-1细胞AMPK磷酸化活性(p-AMPK/t-AMPK比值)较NG组显著降低(P=0.005)；HG+10nM Ex-4组HBZY-1细胞AMPK磷酸化活性较HG组显著增高(P=0.009)； 4.Exendin-4对HBZY-1细胞LC3-Ⅱ蛋白表达的影响： HG组HBZY-1细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达量较NG组显著降低(P=0.000):HG+10nMEx-4组HBZY-1细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达量较HG组显著增高(P=0.034)。 [结论] 1.Exendin-4呈浓度依赖性改善高糖刺激下HBZY-1细胞的自噬功能； 2.高糖抑制HBZY-1细胞AMPK磷酸化活性,Exendin-4可干预该抑制作用； 3.高糖刺激下HBZY-1细胞AMPK磷酸化活性降低与自噬抑制有关,Exendin-4可能通过激活AMPK改善高糖刺激下HBZY-1细胞的自噬功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R587.2;R692

【参考文献】