毛细管电泳—发光二极管诱导荧光分析蛋白质

发布时间：2018-10-07 20:55

【摘要】：膀胱肿瘤诊断的传统方法有膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查,而肿瘤标志物检查已成为一种新趋势,是更先进的检查方法。理想的膀胱肿瘤标志物应该敏感度高、特异性强,能对大范围人群进行膀胱肿瘤筛查,使膀胱肿瘤患者做到早发现早治疗,提高预后和病人的生存年限。利用蛋白质组学,对比正常人与膀胱癌患者尿液蛋白质差异,是寻找肿瘤标志物行之有效的方法之一。毛细管电泳-柱内光纤诱导荧光检测(CE-LED-IF)是一种高效、高灵敏度、能达到痕量分析水平的方法。柱内光纤发光二极管(LED)诱导荧光法,与其他LED诱导荧光检测器结构不同,利用光纤将光子引入到检测窗,直接照射荧光物质,提高了光子的利用率,降低了背景噪声,是高灵敏度的检测方法之一。本文采用CE-LED-IF检测分析人血清白蛋白(HSA),建立其定量检测HSA的方法。在已经建立的电泳流程基础上,对正常人与膀胱癌患者尿液蛋白质进行CE-LED-IF分析,对比分析两种尿液蛋白的差异性,探索CE-LED-IF在膀胱癌检测中的应用价值。研究目的： 1.建立CE-LED-IF定量检测HSA的方法,为CE-LED-IF分析尿液蛋白质奠定基础； 2.对正常人与膀胱癌患者尿液蛋白质进行对比分析,检测两种人群尿液蛋白质的差异性,探索CE-LED-IF在膀胱癌检测中的应用价值。研究方法： 1.本文对仪器的光路耦合与卡槽结构做必要的改进,讨论了荧光素,LED与滤光片,衍生等条件对实验的影响。在优化的条件下对一系列浓度的HSA标准液进行CE-LED-IF检测,得到电泳图,回归方程和检测限,重复性、稳定性和样品回收率。利用建立的检测方法,检测了4个正常人血清中HSA的浓度。 2.采集5例正常人与5例膀胱癌患者尿液,用盐析法提取出尿液中蛋白质。提取出来的蛋白质进行荧光标记后,用CE-LED-IF进行分析,对比两种样本的电泳图,分析其差异性。研究结果： 1.对仪器光路耦合与卡槽结构的不完善之处提出了改进方案,经实验验证,方法有效。选用FITC作为荧光标记物,480nm的LED光源,470nm-490nm和510nm-550nm带通滤光片分别作为光源滤光片和接收滤光片,衍生时蛋白质与FITC的质量比为25：1,衍生时间为4小时。测得HSA与FITC结合物和游离FITC电泳时间分别为210秒和400秒,在1.52～758×10-7mol·L-1范围内线性关系良好。信噪比(S/N)为5时,测得HSA的检测下限为7.5×10-8mol·L-1。重复性、稳定性和回收效率良好。对正常人血清中HSA的浓度测定,结果均在正常范围值之内。 2.正常人与膀胱癌患者尿液蛋白经CE-LED-IF分析后,得到两种样品的电泳图。对比两种人群样品电泳图,膀胱癌患者尿液电泳图中电泳峰的数目明显比正常人多。经多次实验分析,这一差异稳定存在。研究结论： 1.利用改进后的仪器建立的CE-LED-IF检测HSA的方法,可重复性和稳定性好,样品回收率高。为尿液蛋白分析奠定了基础。实验证明,CE-LED-IF可用于人血液中血清白蛋白浓度的检测。而且方法的检测下限低,能用于低浓度的HSA的测量。 2.实验结果显示,CE-LED-IF(?)检测到正常人与膀胱癌患者尿液蛋白质的差异性,这一方法在尿液蛋白质分析、膀胱癌标志物探索中存在潜在应用价值。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：O657.3;R737.14

【参考文献】