关键基因遗传变异、代表性EDCs暴露及其交互作用在精子生成中的作用

发布时间：2018-11-05 17:42

【摘要】：不孕不育一直是生殖健康领域亟待解决的重大科学问题。在我国约有10%的育龄夫妇面临此种困境。由于我国人口基数大,育龄夫妇数量尤为可观,新婚夫妇中不孕不育的患者人数远超过百万。不孕不育症的病因很多,其中由男方因素引起的约占50%。研究表明,半个多世纪以来,人类精液质量显著下降,精子生成障碍已成为男性不育最常见的病因,也是我国成年男性生殖健康面临的最主要威胁。精子生成障碍可能与遗传因子改变(如单核苷酸多态性,SNP)、环境污染物(如环境内分泌干扰物,EDCs)等密切相关。实验室前期通过非梗阻性无精子症(NOA)全基因组关联研究(GWAS)已经发现并验证了3个与NOA显著关联的风险区域(1p13.3、1p36.3和12p12.1),但仍无法完全解释精子生成障碍的病因。由于短时间内遗传变异造成的影响是有限的,所以精子生成障碍也有可能受到了EDCs的影响。实验室前期已利用代谢组学平台建立了一系列EDCs内暴露水平的检测分析方法。我们的研究假设是：1.生精关键基因遗传变异与精子生成障碍易感性有关；2.关键基因遗传变异与环境内分泌干扰物暴露之间存在交互作用,进而影响精子生成。为验证上述假设：1.基于前期NOA的GWAS研究数据,采用大样本病例-对照研究方法,利用高通量测序、基因芯片等技术,全面筛检与精子生成障碍相关的遗传变异；2.通过检测代表性EDCs在人群中的内暴露水平,整合个体的遗传信息,评价基因-环境交互作用在精子生成障碍中的作用。第一部分非梗阻性无精子症(NOA)全基因组关联研究(GWAS)易感区域、关键基因遗传变异与精子生成障碍第一节NOA全基因组关联研究易感区域遗传变异与精子生成障碍目的精子生成障碍已成为男性不育最常见的病因,也是我国成年男性生殖健康面临的最主要威胁。非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是男性不育最严重表现形式,约占男性不育的百分之一。实验室前期在NOA全基因组关联研究(genome wide association study,GWAS)中发现3个NOA易感区域(1p13.3、1p36.3和12p12.1).GWAS作为寻找复杂疾病和性状遗传易感变异的有效手段被广泛用于各项研究,但其结果并不能完全解释疾病的遗传异质性。同时,由于基因芯片仅包含已报道的常见的遗传变异,造成具有潜在功能的低频及罕见突变被漏检。由此,我们推测GWAS发现的3个易感区域存在与精子生成障碍相关的低频及罕见遗传变异。方法采用两阶段病例对照研究寻找易感区域与NOA相关的低频及罕见遗传变异。第一阶段采用96对配对的病例对照样本,通过二代测序技术,对3个无精子症发病风险相关联区域(1p13.3、1p36.3和12p12.1)附近基因(PEX10、PRMT6、 SIRPA、SIRPG和SOX5)潜在功能位置(包括外显子、启动子及UTR区)进行深度测序,筛选与生精障碍相关的遗传变异。第二阶段则采用大样本独立人群(522个病例484个健康生育对照)验证第一阶段筛选的与精子生成障碍相关的遗传变异。结果通过深度测序,总计筛选出六个与精子生成障碍相关的遗传变异位点：SIRPA基因上两个新的突变分别位于chr20.1902132和chr20.1902301, SIRPG基因rs1048055和rs2281807, SOX5基因的rs11046992和rs146039840。通过独立人群验证,我们发现SIRPA chr20.1902301GA的突变会降低精子生成障碍风险性[odds ratios (OR)0.47,95%confidence intervals (CI)0.28-0.80](P=6.00×10-3)。Chr20.1902301GA的突变能引起Val233Ile的氨基酸改变,且GA基因型在病例中的分布(4.23%)明显低于正常对照组(8.60%)o SIRPG rs1048055多态能够增加精子生成障碍的风险(OR3.93,95%CI1.59-9.70)(P=3.00×10-3)。结论通过对NOA全基因组关联研究风险区域进行高通量测序,发现了新的与生精障碍风险相关的罕见突变,为精子生成障碍及男性不育的分子诊断和靶向治疗提供了理论依据。第二节NOA全基因组关联研究关键通路基因遗传变异与精子生成障碍目的 GWAS是研究复杂疾病遗传变异的有力手段,近期实验室前期针对NOA的GWAS研究发现了3个与生精障碍的风险位点(1p13.3、1p36.3和12p12.1)。这些变异位点经历严格的多重比较校正,仅能解释非梗阻性无精子症很小一部分病因。大部分没有通过GWAS界值(P10-8)且效应“温和’’的位点在GWAS研究中被忽略。在前期研究的基础上,我们采用大样本病例对照研究(1653例生精障碍病例和2329例正常生育对照)方法,寻找未达到GWAS界值的可能在精子生成过程中发挥潜在作用的遗传变异位点。方法基于NOA的GWAS数据库,采用归因(imputation)和通路分析方法(pathway analysis)总共分析了与精子生成相关的11条通路(凋亡、细胞周期、MAPK、PI3K-AKT、TGF-β、NF-kB、WNT、核受体及染色质重塑等通路)中基因的24238个SNP位点,寻找到40个在GWAS阶段和imputation阶段都与无精子症关联且方向一致的位点。然后在大样本独立人群中,采用Taqman OpenArray方法进行验证。结果通过对GWAS数据和我们的两阶段验证数据联合分析,发现位于染色质重塑通路的CHD2基因rs1406714位点能够降低精子生成障碍的风险(odds ratio (OR)=0.78,95%confidence interval (CI)=0.68-0.89, Pmeta=1.7×10-4),而位于核受体通路的GNAO1基因rs2126986和凋亡通路中BCL2基因rs7226979位点则会增加生精障碍的风险(rs2126986:OR=1.28,95%CI=1.15-1.41, Pmeta=2.3×10-6; rs7226979:OR=1.21,95%CI=1.11-1.33, Pmeta=4.5×10-5)。结论通过采用归因分析及通路分析方法,首次发现了两个新的与NOA风险相关的基因。我们的研究为寻找精子生成障碍相关基因提供了新的视野,也能够为全基因组关联研究的结果提供补充,为精子生成障碍和男性不育的病因学提供理论依据。第二部分代表性EDCs暴露、关键基因遗传变异互作与精子生成障碍第一节植物雌激素暴露、代谢酶基因遗传变异互作与精子生成障碍目的植物雌激素是一类来源于植物的代表性EDCs,大量存在于豆类植物和含豆粉食物。由于中国的传统饮食习惯,人们有大量的机会暴露于植物雌激素。植物雌激素能够与雌激素受体结合,发挥拟雌激素效应影响男性生殖功能。目前中国汉族人群中还未见植物雌激素暴露对男性生殖功能影响的报道。此外,个体对植物雌激素的代谢能力是否会改变植物雌激素对生殖功能影响还不清楚。本研究从个体对植物雌激素的代谢能力出发,研究植物雌激素暴露、个体易感性与植物雌激素代谢之间是否存在交互作用并影响男性生殖功能。方法通过超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)方法,分析了1001例(600例不育病例,401例正常生育对照)汉族非职业男性尿液中两种植物雌激素原型(开环异落叶松酚和大豆苷元)及他们的三种代谢产物(肠二醇、肠内酯和雌马酚)的内暴露水平,评价植物雌激素暴露及其代谢对精子生成及男性不育的影响。同时结合GWAS研究数据,采用Taqman方法同时对这部分人群的代谢酶多态进行了研究。通过似然比检验和逐步回归法,探讨了植物雌激素暴露、代谢酶基因遗传变异互作对男性不育的影响。结果高暴露于开环异落叶松酚(SEC)会增加精液参数异常及男性不育的风险(odds ratio (OR)=1.78,95%confidence intervals (CI)=1.28-2.49,Ptrend=8.00×10-8),但是其代谢产物(肠二醇和肠内酯)则会降低男性不育的风险(OR=0.53,95%CI=0.38-0.73, Ptrend=4.00×10-8)。由于单独考虑原型或代谢物的暴露存在偏移,我们采用代谢率全面评价植物雌激素暴露对男性生殖功能的影响。发现SEC较低的代谢率能够增加男性不育的风险(OR=2.49,95%CI=1.78-3.48, Ptrend=8.00×10-8)。且SEC的代谢率与CYP2B6rs1042389、CYP1A1rs1048943和NAT2rs1799931之间存在交互作用,会增加精液质量异常及男性不育的风险(Pinter=1.06×10-4,1.14×10-3,3.55×10-3)。结论通过检测人群尿液中植物雌激素原型及其代谢物的内暴露水平,分析个体代谢能力的差异及其遗传背景,发现个体对于植物雌激素的代谢能力与遗传背景存在着密切关联,并且存在交互作用影响男性生殖功能。我们的研究为建立中国人群的植物雌激素暴露数据库提供了基础资料。第二节环境酚类暴露、关键基因遗传变异互作与精子生成障碍目的辛基酚和氯酚均属于EDCs中的代表性酚类物质,用于有机合成、医药、农药、油漆等各个行业,能够干扰体内雌激素和雄激素的平衡而影响男性生殖功能。目前有关汉族人群中辛基酚和氯酚类暴露与男性不育的研究几乎是空白,缺乏流行病学资料。我们通过代谢组学平台研究了辛基酚和氯酚暴露是否与精液质量及男性不育相关,其中关键基因遗传变异是否也发挥潜在作用。方法采用UPLC-MS/MS检测汉族非职业人群(589例男性不育病例和396例正常生育男性)尿液中辛基酚(4-t-辛基酚和4-n-辛基酚)和氯酚(2,3,4-三氯酚和2,4,5-三氯酚)的内暴露水平,采用Taqman方法检测这些个体的代谢酶多态。通过logistic多因素回归及似然比检验,分析酚类物质暴露与个体遗传背景是否存在交互作用及其对精子生成的影响。结果研究发现,高暴露于4-t-辛基酚能够显著增加男性不育的风险(Ptrend=1.70×10-7),且高暴露于4-t-辛基酚与CYP2C9rs4918758. CYP2C19rs4986894和CYPlAl rs1048943存在交互作用,增加男性不育的风险(Pinter=6.05×10-7,8.09×10-7,3.73×10-4)。其中,4-t-辛基酚暴露与CYP2C9rs4918758之间的交互作用最显著,随着暴露水平的增加,男性不育的风险呈单调递增趋势。在包含rs4918758突变型的TC/CC组,低暴露组相对于无暴露组,odds ratio (OR)=2.26,95%confidence intervals (CI)=1.06-4.83,而高暴露组相对于无暴露组则OR=9.22,95%CI=2.78-30.59。结论通过大样本人群研究,发现4-t-辛基酚暴露与个体代谢酶多态之间存在交互作用,本研究为4-t-辛基酚暴露的高危人群筛选和危险度评估提供了科学依据,有助于阐明引起精子生成障碍和男性不育的环境危险因素。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R698.2

【共引文献】