华蟾素对肾癌细胞体外生长及相关功能的影响

发布时间：2018-11-08 15:02

【摘要】：目的本实验拟初步研究华蟾素在治疗肾癌(RCC)中的治疗效果,在体外培养人786-0肾癌细胞株(Renal cell carcinoma 786-0, RCC 786-0),应用华蟾素对该细胞株进行干预,研究华蟾素对RCC 786-0增殖、凋亡和侵袭力的影响以及对细胞内凋亡相关基因的作用。探讨华蟾素在RCC治疗中的可能性,并进一步研究其在抗肿瘤中的作用机制。方法取人RCC 786-0,在适宜的条件下进行传代培养；待细胞生长稳定后将细胞株进行分组,设置若干组分别应用不同浓度的华蟾素作用于RCC786-0,采用CCK8法观察各组细胞增殖的情况,筛选出最佳抑制浓度和时间点；根据结果分设三组：空白组、最佳抑制浓度组、阳性对照组(5-氟尿嘧啶),分别作用RCC 786-0,在最佳抑制时间后用流式细胞仪检测各组RCC细胞凋亡及周期的变化；用Transwell法检测各组RCC细胞侵袭力的变化情况；筛选促凋亡相关基因Bax和caspase-3以及抗凋亡相关基因Bcl-2作为检测指标,分别采用QPCR和Western blot技术在RNA和蛋白水平对其表达情况进行检测。结果华蟾素在0.1mg/ml剂量下作用24h,抑制RCC 786-0活性达到最佳(p0.01)。华蟾素组G0/G1期细胞所占比例较对照组增加,S期无显著变化,G2/M期细胞比例较对照组减少。提示华蟾素能够将RCC细胞阻滞于GO/G1期,抑制细胞DNA复制。浓度为0.1mg/ml的华蟾素对RCC 786-0作用24h后,可以明显抑制细胞侵袭力。QPCR结果示：RCC 786-0在浓度为0.1mg/ml的华蟾素作用24h后与对照组比,Bax表达明显提高,Bcl-2表达明显降低,caspase-3表达无明显变化。Western blot检测结果显示,RCC 786-0在浓度为0.1mg/ml的华蟾素作用24h后与对照组比,Bax和caspase-3表达明显提高,Bcl-2表达明显降低。结论华蟾素可抑制RCC细胞生长,阻滞细胞周期于GO/G1期,其作用机制可能与抑制细胞DNA的复制有关。华蟾素能够抑制RCC细胞侵袭力,其诱导RCC细胞凋亡机制可能与上调促凋亡相关基因Bax,下调抗凋亡相关基因Bcl-2的表达有关。
[Abstract]:Objective to study the therapeutic effect of cinobufacin in the treatment of renal cell carcinoma (RCC), to culture human 786-0 RCC cell line (Renal cell carcinoma 786-0, RCC 786-0 in vitro, and to intervene with cinobufacin in this cell line. To study the effects of cinobufacin on the proliferation, apoptosis and invasion of RCC 786-0, and on the apoptosis-related genes in cells. To explore the possibility of cinobufacin in the treatment of RCC and to further study its mechanism of anti-tumor. Methods Human RCC 786-0 was subcultured under suitable conditions. After the cell growth was stable, the cell lines were divided into groups, and some groups were treated with different concentrations of cinobufonin to observe the proliferation of the cells in each group by CCK8 method, and the best inhibitory concentration and time point were selected. According to the results, they were divided into three groups: blank group, optimal inhibitory concentration group and positive control group (5-fluorouracil), respectively. After the best inhibition time, the apoptosis and cell cycle of RCC cells in each group were detected by flow cytometry. The invasiveness of RCC cells in each group was detected by Transwell assay. The expression of apoptosis-related genes (Bax and caspase-3) and anti-apoptosis-related genes (Bcl-2) were detected by QPCR and Western blot at RNA and protein levels, respectively. Results the activity of RCC 786-0 was inhibited by cinobufacin at the dose of 0.1mg/ml for 24 h (p0.01). The percentage of cells in G0/G1 phase in cinobufacin group was higher than that in control group, but there was no significant change in S phase, and the proportion of cells in G 2 / M phase was lower than that in control group. These results suggest that cinobufacin can block RCC cells in GO/G1 phase and inhibit DNA replication. The results of QPCR showed that the expression of RCC 786-0 in RCC 786-0 was significantly higher than that in the control group, and the expression of RCC 786-0 was significantly increased compared with that of the control group after 24 hours of treatment with cinobufacin at the concentration of RCC 786-0.The results of QPCR showed that the expression of RCC 786-0 was significantly higher than that of control group. The expression of Bcl-2 was significantly decreased, but the expression of caspase-3 was not changed. The results of. Western blot detection showed that the expression of Bax and caspase-3 was significantly higher in RCC 786-0 than that in control group after 24 hours of treatment with 0.1mg/ml. The expression of Bcl-2 was significantly decreased. Conclusion cinobufacin can inhibit the growth of RCC cells and block the cell cycle in GO/G1 phase. The mechanism may be related to the inhibition of DNA replication. Cinobufacin can inhibit the invasiveness of RCC cells, and its mechanism of inducing apoptosis in RCC cells may be related to the down-regulation of the expression of anti-apoptosis-related gene Bcl-2 by up-regulating the apoptosis-related gene Bax,.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11

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本文编号：2318833