骨髓间充质干细胞来源exosome对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

发布时间：2018-11-15 19:59

【摘要】：目的：探讨骨髓间充质干细胞(Bone marrow Mesenchymal stem cells,BM-MSC)来源exosome对大鼠肾缺血再灌注损伤(Ⅰschemia Reperfusion Injury,IRⅠ)的保护作用及机制。方法：(1)采用贴壁细胞分离法分离培养大鼠MSC,使用流式细胞术检测MSC表面分子标志CD44、CD2、CD34。加入成骨细胞、成脂细胞诱导培养液,观察MSC向成骨细胞、脂肪细胞的分化能力,鉴定其多向分化潜能。(2)采用TotalExosome Isolation Reagent结合超速离心法提取MSC及成纤维细胞(HFL-1)培养上清中的exosome。透射电镜下观察exosome的形态特点及粒径大小,并使用流式细胞术检测exosome表面分子标志CD63表达情况。(3)选取雄性SD大鼠200-250g共30只,随机分为假手术组(Sham组),缺血再灌注损伤组(IR组),MSC处理组(IR+MSC组),MSC来源exosome处理组(IR+MSC-ex组),成纤维细胞来源exosome处理组(IR+F-ex组)。构建IR损伤模型,夹闭左侧肾蒂45分钟,开放左肾动脉时切除右肾,在IR损伤即刻经颈动脉注入MSC或exosome,IR组给予等量P BS,Sham组仅游离肾蒂后关腹。(4)术后48h处死大鼠,留取全血、肾组织福尔马林固定标本及肾组织液氮冰冻标本。检测血清肌酐和尿素氮水平,HE染色观察肾脏组织形态学改变并根据Paller标准行病理评分,TUNEL染色评价细胞凋亡,肾脏冰冻标本提取蛋白质及RNA,PCR检测炎症因子IL-1 β、TNF-α表达水平,Western印迹法检测肾组织Caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、P-Akt表达水平。结果：(1)MSC生长特征：大鼠骨髓MSC呈长梭形贴壁生长。传代后,细胞增殖明显,高度融合,呈漩涡状或辐射状排列。流式细胞术检测其表面高表达CD29、CD44,低表达CD34。经成骨及成脂诱导液培养后,MSC成功分化为成骨细胞和脂肪细胞。(2)Exosome特征：透射电镜下观察,提取物为微囊泡样小体结构,圆形或椭圆形,大小均一,直径在30-60nm。流式细胞术检测其表面标志CD63表达阳性,证实提取物为exosome。(3)对肾功能的作用：再灌注后48小时,MSC组、MSC-ex组血肌酐(分别为147.5±15.89,231.5±30.03)、尿素氮(分别为20.49±5.70,31.36±5.53)与IR组(482±36.87,45.42±2.73)相比均显著降低；MSC-ex组与F-ex组肌酐(442±41.98)、尿素氮(46.89±3.21)相比,肾功能也显著改善,差异均具有统计学意义。(4)肾脏病理变化比较：HE染色切片观察,MSC组、MSC-ex组与IR组相比,病理损伤明显减轻,Paller评分(分别为22.50±6.28,35.17±7.57)与IR组(59.50±8.12)相比显著降低(均P0.001)；MSC-ex组(35.17±7.57)与F-ex组(58.67±8.59)相比也显著降低(P0.01)。(5)凋亡比较：TUNEL染色检测肾小管上皮细胞凋亡,MSC组、MSC-ex组阳性细胞数(分别为5.17±1.17,8.67±1.63)与IR组(13.67±1.86)相比明显减少(P0.001,P0.01)；MSC-ex组(8.67±1.63)与F-ex组(12.67±1.75)相比也明显减少(P0.01)。(6)炎症因子变化：实时定量PCR检测各组炎症因子IL-1β、TNF-α表达,再灌注后48小时,IR组炎症因子水平明显升高,与IR组相比,MSC组与MSC-ex组的IL-1β表达无明显差异(P0.05),而TNF-α表达水平则明显降低(P0.01)；与F-ex组相比,MSC-ex组IL-1β表达无明显差异(P0.05),TNF-α表达明显减少(P0.05)。(7)蛋白水平变化：、Vestern blot检测凋亡相关通路蛋白表达,与IR组、F-ex组相比,MSC与MSC-ex组Caspase-3、Bax蛋白表达减少(P0.05),而Bcl-2、PI3K、P-Akt蛋白表达水平则明显升高(P0.05)。结论：(1)MSC来源exosome对大鼠肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用。(2)MSC来源exosome通过减轻炎症反应,激活P13K-Akt信号通路促进肾小管上皮细胞增殖、抑制凋亡从而发挥其肾脏保护作用。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692

【参考文献】