人前列腺间充质干细胞的生物学特性及其多分化潜能研究

发布时间：2018-11-15 23:18

【摘要】：引言：人类组织间充质干细胞(hMSCs, human mesenchymal stem cells)是一类非造血系的基质或间充质祖细胞,它可以自我更新并分化成为多种不同的间质组织,包括骨、脂肪、肌肉以及软骨,其中从骨髓中提取的hMSCs又叫骨髓基质细胞。近年来由于人们发现它有和胚胎干细胞类似的多分化潜能,同时在体外实验中易于提取和扩增,以及它潜在的医疗和科研价值,已经引起了研究者们广泛的关注。在本研究的实验构思中本研究相信其中前列腺基质细胞在良性前列腺增生和前列腺癌中提供了肿瘤发生、发展以及治愈过程中的生态位和细胞微环境。同时基质细胞在局部形成了一个内皮细胞、肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞以及成骨细胞的前体池,该前体池或许包含了最原始的间充质干细胞,即本研究假设出的多潜能基质细胞人前列腺间充质干细胞(hPMSCs, human prostate-derived mesenchymal stem cells)。相对于前列腺上皮干细胞的相关研究本研究对hPMSCs它的生物特性依然比较模糊,甚至hPMSCs这一名称在内外文献中尚未见报道。这可能是由于本研究发现和分离hPMSCs的方法不同,分离后对hPMSCs的处置不同,以及hPMSCs尚无可以作为金标准的特异的细胞分子表面标志物,加之来源于不同病患和不同部位的hPMSCs自身也存在差异,最后还有研究hPMSCs分化潜能的诱导途径也不一致,导致hPMSCs这一概念由于过于混沌而尚未建立起来。因此目前国内外尚无人在这一领域发表成果。本研究的实验对象和目的正是探索和研发从人良性前列腺增生组织基质分离人类前列腺间充质干细胞的方法,从而鉴定出它们独有的生物学特性。希望通过本研究使本研究从hMSCs中衍生出“前列腺间充质干细胞hPMSCs"的概念,从而探索出一条研究前列腺肿瘤发生、诊断和治疗的途径并丰富人组织来源间充质干细胞的概念。实验目的：通过本实验本研究期待解释以下科学问题：1)证实人前列腺hPMSCs的存在并鉴定出人前列腺hPMSCs基本生物学特性。2)通过从以下各种分选方式得到的人前列腺间充质单核细胞亚群,贴壁粘附法人前列腺间充质单核细胞亚群,免疫磁珠阳性分选单一抗原CD105, CD133和CD271人前列腺间充质单核细胞亚群各自分别建立起单一纯化的人前列腺hPMSCs,同时摸索出其标准的体外培养条件。3)研究和比较各hPMSCs亚群向内胚层成骨细胞以及脂肪细胞和外胚层神经细胞分化的潜能。4)通过实验证实CD133和CD271单克隆阳性分选的hPMSCs可以作为理想的前列腺疾病研究临床和科研的种子细胞,表面抗原CD133和CD271也就是分离人前列腺间充质干细胞最有效率的表面标志物。同时为人前列腺来源的hPMSCs的培养和体外干细胞活性的维持提供实验方法和依据,为研究hPMSCs与前列腺肿瘤的发生,发展以及治疗奠定基础。材料和方法：本实验以接受了前列腺电切术后(TURP)病人增生的前列腺组织标本,所有标本的获取均得到了英国爱丁堡大学医学伦理学委员会的认证。获取的前列腺组织标本经过Percoll液(d=1.073g/m1)提取出了hPMNCs细胞混悬液之后并培养扩增到第一代之后,hPMNCs被分成了3份(3/5,1/5和1/5),其中的3/5本研究平均的分成了3份,这3份前列腺单核细胞本研究分别用CD105、CD133和CD271单克隆抗体阳性免疫磁珠进行分选,而其余的一个1/5本研究直接用粘附贴壁法分选出了PA前列腺单核细胞亚群,另一个1/5本研究直接将它培养到第三代作为对照细胞株。通过以上的处理本研究分别获得了5个亚群的细胞,之后本研究将分选出的各细胞亚群接种在T75培养瓶内,给予完全培养基CCM (Complete Culture Medium)培养到第三代(P3)。为了保持对照实验结果评估的一致性,本研究将所有五个前列腺间充质干细胞分选亚群(前列腺单核细胞亚群,PA前列腺单核细胞亚群以及单克隆抗体阳性CD105、CD133和CD271阳性亚群)在体外培养到第三代(P3)。通过不同的分选流程得到了可稳定传代的以下五个细胞亚群：贴壁粘附法人前列腺间充质单核细胞亚群,免疫磁珠分选单一抗原CD105,CD133和CD271和人前列腺间充质单核细胞亚群并分别对它们的生物特性进行了系统性的研究,并同时探讨了它们在体外向内胚层成骨细胞以及脂肪细胞和外胚层神经细胞分化的潜能(通过比较各亚群茜素红S和油红0染色能力以及免疫荧光照相和PCR分析),各部分的实验方法概要如下：成纤维细胞样克隆生成单位计数(Colony forming units-Fibroblast,CFU-F)：为了测定该五个亚群间充质干细胞形成成纤维样集落克隆的能力,以上五个细胞亚群均消化后重新种植在成纤维细胞样克隆生成培养液MACS NH CFU-F Medium (Miltenyi Biotec Co, Germany, order no130-091-676)中9天并被种植在1%凝胶镀膜过的六孔板内。在第9天六孔板被以蒸馏水漂洗,之后以甲醇固定并且用结晶紫细胞染液进行大体染色同时克隆形成单位被计数统计(成纤维集落克隆形成单位的能力代表了非造血系干细胞其生长以及分化的能力)。流式细胞仪检测(Flow Cytometry,FCM):这四个细胞亚群的膜表面标志物,本研究使用BD公司生产的鼠抗人细胞膜抗体,其中特异性的间充质干细胞抗体包括CD73、CD44、CD105、CD90和CD166以及造血系干细胞膜表面标志物CD14,CD34以及CD45。总的来说本研究将1×105个细胞洗脱下来并在黑暗中在4。C孵育30mins。孵育后的细胞被重新漂洗同时使用Coulter FACS XL-MCL流式细胞仪进行检测。成骨分化诱导：为了揭示间充质干细胞成骨分化的能力本研究从以上各亚群的1×105个前列腺间充质干细胞中分别置于德国美天旎生物公司的非造血系成骨分化培养液(Miltenyi Biotec, Germany,order no.130-091-678)的6孔板中。所有这些细胞每3天换液1次并连续培养四周,本研究从第9天开始可以观察到为了评价各亚群成骨分化的能力培养板,首先以磷酸盐缓冲溶液漂洗干净之后在每孔中滴入4%多聚甲醛两mins进行固定,最终以蒸馏水洗净。培养板在茜素红染液中漂染一mins,最终以乙醇溶液清洗干净从而获得生成的磷酸钙结节(红色)并进行美国Dynex公司MRX(?)酶标仪OD值读取。成脂分化诱导：为测定以上各的亚群细胞成脂分化潜能,本研究在六孔板中分别放入1×105个洗脱下的细胞,将细胞更换非造血系成脂分化培养液(130-091-677)。所有细胞每周换液两次并连续培养四周,之后以油红将细胞中的脂滴进行染色,洗脱后以美国Dynex公司MRX(?)II酶标仪进行0D值读取比较其各组成脂分化能力。神经分化诱导：为了检测CD271单克隆抗体阳性分选亚群向神经分化的潜能,1×105个细胞被平均的种植于12孔板。同时种植后给予更换成非造血系N2B27培养液(Stem Cell Sciences Co, USA, Catalogue Number:SCS-SF-NB-02)先预培养48小时,以保证细胞对分化培养液的适应。之后本研究在更换的N2B27培养液中加入NGF(神经生长因子,30ng/m1),FGF-b(纤维母细胞生长因子-b,20ng/m1)以及RA(全反式维甲酸,0.5ug/m1)。在培养的48及72小时后将每组中的一个培养板分别进行荧光染色固定从而测它们表达GFAP以及NESTIN的表达,其表达的效率本研究通过荧光染色显微镜来观察。荧光染色处置中,本研究先将培养板以磷酸盐缓冲溶液清洗,之后使用4%的甲醛溶液中固定5mins,最终以蒸馏水漂洗干净。染色阶段,第一步细胞被固定并且用非特异性蛋白进行阻滞。第2部两个抗体被分别的加入到之上不同亚群的培养孔中。最终细胞都与荧光标记的第二级抗体共同作用30mins从而将目的基因蛋白在荧光显微镜下标识出来。实验结果：在此研究中本研究综合评价了五个细胞亚群：①未纯化的前列腺基质单核细胞hPMNCs。②粘附贴壁法分选得到的hPMSCs。③细胞表面标志物CD105阳性前列腺基质单核细胞CD105-hPMSCs。④细胞表面标志物CD133阳性前列腺基质单核细胞CD133-hPMSCs。⑤细胞表面标志物CD271阳性前列腺基质单核细胞CD271-hPMSCs。通过对以上五个细胞亚群之间以下等项目的比较：(1)细胞生长特性。(2)成纤维细胞样克隆生成单位(Colony forming units-Fibroblast,CFU-F)的效率比较。(3)对各细胞亚群间充质干细胞相关标志物表达(CD105,CD166, CD34, CD271, CD73, CD105, CD45, CD14)的测定。(4)比较以上五个细胞亚群它们成脂、成骨、成神经体外分化的潜能以及效率。结果罗列如下：免疫磁珠分选结果：经过本研究的实验证实了免疫磁珠体外纯化人前列腺间充质单核细胞中CD105,CD133和CD271阳性细胞亚群的可行性,本研究取良性前列腺增生患者前列腺电切标本并制备单细胞悬液,采用免疫磁珠分选法分选出CD105,CD133和CD271阳性细胞亚群,并在镜下使用台盼蓝细胞染色观察分选前后的细胞活力,并用流式细胞测定纯化前后CD105,CD133和CD271的阳性表达率。本研究发现通过免疫磁珠单克隆抗体分选后所得CD105细胞纯度为(97.3±1.86)%,通过免疫磁珠单克隆抗体分选后所得CD133细胞纯度为(88.3±3.06)%通过免疫磁珠单克隆抗体分选后所得CD271细胞纯度为(89.5±1.8)%。纯化前后的间充质细胞活力无统计学差异(P0.05)。因此本研究得出结论,应用CD105,CD133和CD271作为hPMSCs的分子表面标志及德国美天旎生物公司(Miltenyi Biotec Co, Germany)的免疫磁珠分选系统可从人良性前列腺增生患者前列腺电切标本直接分选得到高纯度的CD105,CD133和CD271阳性前列腺间充质干细胞,同时该分选系统处理的细胞活力在分选中不受影响。通过显微镜下细胞形态学观察：本研究分选出的5个hPMSCs前列腺间充质干细胞亚群均具有人类组织间充质干细胞基本的生物学特性,在显微镜下大多数细胞呈现小梭形,核仁明显,其中细胞核较大,而且混杂的扁平的细胞极少。本研究在体外给予10%胎牛血清FBS加α-MEM培养,在细胞生长到80%融合时传代,其各亚群细胞在体外传代35pd,生长状态仍然良好。当细胞融合接近100%时呈现旋涡状或平行排列。本研究取第三代的hPMSCs来绘制细胞生长曲线,经计算其对数生长期倍增时间约为26±2.3小时。成纤维细胞样克隆生成单位结果：本研究将分选出的五个前列腺间充质干细胞亚群分别培养在六孔板内,用德国美天旎生物公司非造血系成纤维细胞样克隆生成培养液培养9天。结果本研究观察到免疫磁珠分选得到的CD271和CD133阳性亚群获得了最多的成纤维细胞样克隆生成单位(Colony forming units-Fibroblast, CFU-F)数,分别是51±7.31and76±10个集落生成,它们的克隆集落数与MNC相比多了3倍以上而且CD271和CD133它们的融合速度也远远快于其他三个细胞亚群。流式细胞术结果：本研究分选出的hPMSCs高表达间充质基质细胞表面标志而不表达造血系的表面标志。流式细胞仪检测体外扩增第3代的细胞,结果显示它们均不表达CD14,CD45,而高表达CD73,CD90,CD105,CD166,以及表达基质细胞的分子标志CD44,不表达造血干细胞的分子标志CD34,也不表达CD45和CD14。 hPMSCs成骨和成脂分化：本研究取P3代的各亚群hPMSCs细胞在德国美天旎生物公司(Miltenyi Biotec Co,Germany)的成脂和成骨分化液中分别培养28天和9天后观察其内的脂滴和该结节形成并且通过油红0和茜素红染色后洗脱进行定量比较,本研究发现结果和它们的增殖能力一致,CD271和CD133亚群的成脂和成骨能力远高于其他三个亚群。在本研究的实验中CD271阳性免疫磁珠分选hPMSCs亚群可在体外诱导分化为外胚层的神经干细胞和神经胶质细胞。体外诱导神经细胞的条件是N2B27培养液中添加3Ong/ml的β-NGF,20ng/ml的FGF-b和0.5ng/ml的RA。在培养48小时后细胞形态学发生改变,一些细胞的胞质收缩,细胞体内向外伸出双极和多极的长突出。在有些细胞中可以观察到生长锥以及丝突样的结构,免疫组化荧光结果显示分化后的细胞表达神经祖细胞特异性的标志物GFAP和Nestin。本研究应用荧光抗原标记的方法通过免疫荧光显微镜观察到GFAP和Nestin荧光染色阳性细胞,同时通过聚合酶链式反应PCR(Polymerase Chain Reaction)发现神经分化细胞表达GFAP和Nestin,以上这些细胞形态学改变和免疫检测结果表明本研究培养的hPMSCs同样可以在合适的条件下分化成为神经胶质细胞和神经元细胞。同时本研究观察到经过以上诱导出的神经细胞在两周后仍然有60%以上的存活率。本研究使用PCR的方法研究在新鲜获得的CD271阳性免疫磁珠分选亚群成神经分化后表达神经祖细胞早期的特异性标志物(Nestin)和晚期特异性标志物(GFAP)的水平,本研究发现在CD271阳性亚群中CD271和以上两个特异性标志物均有表达而且有价值的是这两个标志物在对照组(未分化组)中均无表达。总之本研究所获得的前列腺间充质干细胞在体外诱导条件具有向内胚层成骨细胞以及脂肪细胞和外胚层神经细胞分化的潜能。综合实验的结果证实本研究培养的前列腺间充质细胞可以被称为前列腺间充质干细胞(hPMSCs)。1)在液氮冻存12个月后复苏测试,冻存的HphMSCs生长状态良好,镜下是均一的小梭形CFU-F显示克隆形成能力仍然很高。2)它们高表达间充质干细胞的各细胞表面分化抗原,而且不表达造血系干细胞的细胞表面分化抗原。3)它们在体外诱导条件可以向内胚层成骨细胞以及脂肪细胞和外胚层神经细胞分化的潜能(通过比较各亚群茜素红S和油红0染色的能力)。由于以上三项均符合本研究对于人组织间充质干细胞的要求,所以本研究认为本研究得到的前列腺基质提取细胞可以被称为前列腺间充质干细胞(hPMSCs). 统计学处理：所有细胞增殖的数据,细胞克隆形成单位,以及相关抗体阳性表达率,0D值读数本研究均通过均数加减标准差x±s进行纳入。各细胞亚群之间的不同本研究进行学生T检验,多组均数间比较进行单因素方差分析,其中方差不齐数据进行非参数检测。所有的统计学分析结果应用SPSS11.5统计软件进行分析(芝加哥,美国)。P0.05被认为有统计学意义。结论和讨论：本研究第一次综合利用了hPMSCs的密度离心法获得了前列腺间充质单核细胞hPMNCs,利用贴壁生长特点获得了贴壁粘附法人前列腺间充质单核细胞亚群PA-hPMSCs,用改进了的免疫磁珠分选法建立了单一纯化的人前列腺间充质干细胞hPMSCs细胞系,免疫磁珠分选CD105,CD133以及CD271单克隆阳性细胞亚群,这五个细胞亚群在体外可以长期稳定增殖并保持分化潜能。本研究的实验结果第次证实了在人前列腺中同样存在人类组织间充质干细胞,它的生长特性类似骨髓干细胞和胎盘干细胞。而且本研究得到的前列腺hPMSCs在经过多次传代或者长期冻存后依然可以维持他旺盛的生长并依然可以分化成神经细胞、成骨细胞和脂肪细胞。至今最常用最经典的是Friedenste.A.J.(1970)和Gronthos.S.(2003)等研究者在体外培养的一些贴壁粘附法分离出的基质细胞可以有克隆集落样生长即可以获得成纤维细胞样克隆生成单位(Colony forming units-Fibroblast, CFU-F),通过进一步研究他们发现这样获得的细胞是混杂细胞系,其中只有一部分从克隆株团中针挑出的培养细胞可以有间充质干细胞杨的多分化潜能,即PA-hPMSCs.就像其他提纯法获得的间充质干细胞,通过粘附贴壁法只可以从人组织中分理出比较混杂的包含间充质干细胞的多个细胞系,通过对这一经典方法获取的细胞和其他分选方式得到的细胞亚群的对比试验本研究期待了解它的基本生物特征。在本研究我们一一比较了对不同分选机制下得到的五个hMSCs亚群不同的增殖活性和分化潜能,本研究的数据揭示了应用不同的分选机制得到的前列腺hMSCs表达不同的生长能力、分化潜能以及不同水平的分化抗原表达,通过阳性分选机制得到的CD271和CD133亚群它们的克隆形成能力是其他亚群的三倍,而且它们的增殖速度也远远快于其他三个亚群,这一可能的机制是因为这两个细胞亚群中细胞的异质性最低,细胞谱系比较单一,这一建议干细胞的活性也许有可能会被其他混杂细胞所抑制。同时低密度种植对于间充质干细胞的增殖很有好处揭示也许细胞过早的融合会导致接触抑制。但在培养过程中本研究发现与初始P0代提纯的CD271单克隆抗体阳性分选亚群和CD133单克隆抗体阳性分选亚群,它们中CD271和CD133的表达在传到第三代的时候将会大量丢失。可能的解释是CD271和CD133阳性分选细胞可以通过分化出CD271和CD133阴性细胞得以保存自身的干细胞活性。通过本研究在体外长期培养获得的数据本研究发现CD271单克隆抗体阳性分选亚群和CD133单克隆抗体阳性分选亚群包含有最少的造血系细胞混杂,通过CD45的流式细胞仪检测发现其表达最低的阳性率(分别为1.66%和2.17%)。而CD105相对HPMNC和PA-hPMSCs有中间水平的CD45表达(4.39%),也许这种CD45的低表达可以解释CD271单克隆抗体阳性分选亚群和CD133单克隆抗体阳性分选亚群在本研究中最高的增殖活性和分化潜能。综合以上两点因此本研究认为作为人前列腺间充质干细胞理想的分离和鉴定表面标志物是应该能最大程度的代表那些极少存在于基质中的同时又基本上不表达造血系细胞表面标志物的那些多潜能干细胞,本研究的研究结果表明通过免疫磁珠单克隆富选下的CD271和CD133表达阳性亚群是所有目前已知选项中拥有最强自我增殖能力和分化能力的前列腺间充质干细胞亚群。作为前列腺间充质干细胞研究的前沿对干细胞分选和培育的金标准的建立迫在眉睫,本研究的研究展示了对于人前列腺间充质干细胞从人的阳性前列腺增生良性术后标本这一免疫磁珠为基础的目的基因标志分选方法是可行的,本研究的数据显示CD271即低亲和力神经生长因子受体(Low affinity nerve growthfactor receptor,LNGFR)以及CD133可以作为可行的分选标志物来富集人前列腺间充质干细胞。在最后本研究所使用的这项方法亦可完全被复制到分选前列腺癌间充质干细胞中去。本研究同样显示了通过CD133和CD271单克隆阳性分选的hPMSCs可以作为理想的前列腺疾病研究临床和科研的种子细胞,并为人前列腺hPMSCs的培养和体外干细胞活性的维持提供了实验方法和依据,为研究hPMSCs与肿瘤研究奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2;R697.3

【参考文献】