EGCG作用于HO-1通过抗氧化和抗炎通路保护造影剂肾损伤

发布时间：2018-11-21 12:54

【摘要】：研究背景:造影剂肾病(contrast-induced nephropathy,CIN)的定义为造影剂(contrast media,CM)暴露后48~72h血肌酐绝对值较基础值升高≥0.5mg/dl或相对升高≥25%,并且排除了其他可能引起肾损害的原因。CIN是冠心病介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)中的常见并发症和医源性肾损伤,尤其在高风险人群(如糖尿病、慢性心衰、慢性肾损害、老年)中发病率可高达20%~30%。根据Mehran报道的CIN风险评分系统进行预测,评分6,6~10,11~16,16的患者,其CIN的发生风险分别为7.5%,14%,26%和57%。PCI患者常合并多种慢性疾病,往往是CIN高风险人群。CIN的病程可长可短,病情可轻可重,但至少1%的CIN患者需要透析治疗,CIN是CIN高危患者PCI术后仍预后不良的重要原因之一。CIN的危害不可小觑,CIN的发生可显著升高患者远期发生慢性肾功能不全的几率,而慢性肾功能不全又反过来成为心血管不良事件的强预测因子。尽管为减少CIN的发生人们做了很多努力,如对择期PCI治疗的患者进行CIN风险评估、水化治疗、应用新型更安全的造影剂,但高危患者的CIN风险始终存在;迄今为止,还没有可明确防治CIN的药物(包括N-乙酰半胱氨酸、碳酸氢钠、非诺多巴胺、他汀类、肢端缺血预适应、预防性血透等)。如何有效防治CIN一直是心脏介入医生关心的问题。虽然目前关于CIN发生的机制尚未完全清楚,但普遍认为造影剂对肾小管供氧平衡的破坏和直接细胞毒性是其损伤的主要机制。(1)供氧减少:造影剂可引起肾内血管收缩,肾组织缺血缺氧,尤其是亨氏袢(Henle's loop)升支粗段(medullary thick ascending limb,mTAL)所在的外层髓质最容易受影响,该段的主动重吸收功能耗氧量大;而在合并有慢性肾功能减退的高危CIN患者中,组织局部在生理状态下对微循环的扩张发挥了重要调节作用的一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列腺素(prostanoids,PGs)和腺苷合成却减少,使肾内血管收缩呈持续状态。(2)耗氧增加:造影剂的渗透性利尿作用可加重mTAL的重吸收负荷,耗氧量增多,加重缺氧和线粒体受损。(3)直接细胞毒性:造影剂可引起上皮细胞皱缩,细胞核突起,内皮细胞层断裂,NO合成减少,凋亡、坏死增多,而肾小管的浓缩作用可增强其毒性,使造影剂粘稠度增加,易引起小管阻塞。最终,造影剂诱导的肾缺氧状态触发了小管细胞的氧化应激损伤和炎性反应之间的恶性循环,导致了严重的急性肾损伤(acutekidneyinjury,aki);而不断扩大延伸的持续性自身炎性反应可使aki进展成为慢性肾功能不全。对于肾组织细胞而言,经历了氧化应激、造影剂毒性损伤和坏死组织继发的无菌性炎性损伤的三重打击。因此,一个有效的干预策略应该同时具有阻断氧化应激和炎性反应的作用。表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate,egcg)是从绿茶叶中分离的儿茶素类单体,属于植物多酚的黄酮类化合物,是茶多酚生物活性的主要成份和主要研究对象,在人群研究中已证实可静脉或口服给药,而静脉给药是可以急性期干预的重要条件。大量研究显示egcg在心血管疾病、肺、肝脏和肾脏疾病中具有抗氧化和抗炎作用,在多种动物急慢性肾病模型中有保护作用,如梗阻性肾病、顺铂肾毒性、肾缺血再灌注损伤、体外循环诱导的肾损伤、糖尿病肾病、狼疮性肾病、慢性肾小球肾炎。egcg是否对造影剂肾病有保护作用尚未见报道。本研究通过构建大鼠造影剂肾损伤模型,观察egcg的治疗作用,并探讨egcg保护作用的分子机制。研究目的:本研究拟构建大鼠造影剂肾病模型,观察egcg对造影剂肾损伤的治疗作用,探讨egcg抗氧化和抗炎症的分子信号机制及其作用的关键分子靶点。研究方法:1.首先,构建大鼠造影剂肾病模型:用220~250g雄性sprague-dawley(sd)大鼠,通过顺序静脉注射吲哚美辛、nω-硝基-l-精氨酸甲酯盐酸(nω-nitro-l-argininemethylesterhydrochloride,l-name)、碘普罗胺,建立造影剂肾损伤模型。实验分为溶剂(vehicle)组、cm组和cm+egcg组(n=5),自动生化分析仪测定血清肌酐(creatinine,cr)、尿素氮(bloodureanitrogen,bun)评估肾功能,观察该动物模型肾损伤的72h的自然病程,确定反映肾损伤的最佳观察时间点。2.再通过egcg分组给药进行效果评价:通过不同浓度(5、10、20mg/kgbodywt)的静脉egcg干预观察对血cr、bun、肌酐清除率(creatinineclearance,crcl)的影响,确定用于后续实验的最佳egcg干预浓度。观察不同干预时间点(造模前或后)静脉egcg干预对肾功能、肾组织损伤部位和损伤病理评分(he染色),及细胞凋亡(tunel法)的影响,以全面评估egcg对造影剂肾损伤的治疗效果。3.接着对egcg的抗氧化作用进行评估,并探讨其抗氧化分子机制:用比色法(按试剂盒说明操作)测定肾组织匀浆中氧化应激标志物:脂质过氧化标志物——丙二醛(malondialdehyde,mda)、抗氧化酶——超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod),评价egcg对造影剂肾损伤的抗氧化作用。用免疫印迹法和免疫荧光染色法测定肾组织血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,ho-1)的蛋白表达水平及分布;提取肾组织核蛋白(按试剂盒说明书操作),用免疫印迹法测定核因子e2-相关因子2(nuclearfactore2-relatedfactor2,nrf2)的蛋白表达水平,研究egcg对nrf2/ho-1抗氧化信号通路的影响。4.对egcg的抗炎症作用进行评估,并探讨其抗炎症分子机制:用比色法(按试剂盒说明书操作)测定肾组织匀浆中炎性标志物:白细胞活化标志物——髓过氧化物酶(myeloperoxidase,mpo)、酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)测定前炎症因子白介素-1β(interleukin-1β,il-1β),评价egcg对造影剂肾损伤的抗炎症作用。用免疫印迹法和免疫荧光染色法测定肾组织核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nod样受体)蛋白3(nucleotide-bindingoligomerizationdomainreceptor(nod-likereceptor,nlr)protein3,nlrp3)的蛋白表达水平,探讨egcg对nlrp3炎性小体/il-1β自身炎性通路的影响。5.进一步探讨egcg抗氧化和抗炎症保护作用中的关键分子靶点,观察ho-1抑制剂给药对egcg造影剂肾损伤保护作用的影响:提前用ho-1抑制剂锌原卟啉ix(ii)(protoporphyrinixzinc(ii),znpp)或原卟啉锡(tinprotoporphyrinixdichloride,snpp)腹腔注射抑制全身ho-1的活性(znpp/snpp+egcg+cm组),测定肾功能(血cr、bun),观察ho-1在egcg造影剂肾损伤保护作用中的重要性;测定肾组织氧化应激标志物(mda、sod)、炎性标志物(mpo、il-1β)的变化,观察ho-1抑制对egcg抗氧化和抗炎作用的影响;测定nlrp3表达的变化,观察ho-1抑制对egcg抗炎性信号通路的影响。6.所有数据均采用spss13.0统计软件进行分析,以均数±标准误(mean±sem)表达。计量数据经kolmogorov-smirnov正态和levene方差齐性验证后,多组间比较行one-wayanova和进一步组间bonferroni方差分析。he病理评分组间比较采用非参数kruskal-wallis分析。以p0.05为差异有统计学意义。结果:1.动物模型肾损伤的评估。通过观察72h血cr、bun的变化评价大鼠造影剂肾损伤模型,发现造模后24h血cr、bun明显升高并达到峰值,48h明显回落,72h逐渐恢复正常,24h和48h时间点与vehicle组比较有统计学差异(p0.05)。选择24h作为该模型肾损伤观察的最佳时间点,观察后续实验干预的疗效。2.egcg分组给药的效果评估。(1)不同浓度的egcg(5、10、20mg/kgbodywt)于造模前15min经静脉给药观察对造影剂肾损伤的保护作用,发现三个egcg浓度组均能改善造影剂肾损伤(p0.05),cr较cm组分别降低28%、58%和60%;bun降低27%、48%和53%;crcl升高0.9倍、2.0倍和1.7倍。选择10mg/kgbodywt作为egcg的最佳干预剂量用于后续的实验研究。(2)egcg(10mg/kgbodywt)于造模前/后15min经静脉给药(pre-/post-egcg+cm组),观察围损伤期不同时间点干预的疗效,发现造模后给药能同等程度地改善造影剂肾损伤的血cr、bun(p0.05)。观察肾组织he形态学病理改变,可见造影剂肾损伤主要定位于外髓质层的小管细胞(mtal)。对小管上皮细胞空泡变性/坏死、蛋白管型、间质出血(红细胞)进行半定量病理损伤评分提示造模cm组肾损伤评分显著升高,而egcg造模前/后给药均能减少肾小管细胞的损伤程度(p0.05)。tunel染色计数显示细胞凋亡在造模cm组明显增多,egcg造模前/后给药均能减少肾小管细胞的凋亡程度(p0.05)。3.肾组织氧化应激的变化。(1)取肾组织进行匀浆,测量肾组织mda含量和sod的活性,分别反映氧化应激中脂质过氧化程度和抗氧化酶的水平,发现造影剂肾损伤后肾组织中的mda含量显著升高,sod活性显著降低(p0.05);egcg干预后能明显降低mda含量,升高sod活性,改善损伤肾组织的氧化应激状态(p0.05)。(2)采用免疫印迹法检测肾脏nrf2/ho-1抗氧化信号通路在造影剂肾损伤和egcg保护作用中的变化,发现肾组织ho-1表达在造影剂肾损伤后有所增多(p0.05),egcg干预使ho-1表达较cm组进一步显著升高(p0.05);通过ho-1的免疫荧光染色显示,ho-1主要分布在小管细胞,而非肾小球,造影剂肾损伤及egcg的干预用药均可不同程度地升高皮质和髓质的小管细胞ho-1表达。检测ho-1的上游抗氧化转录因子nrf2的表达,发现造影剂肾损伤后nrf2表达明显下降(p0.05),egcg干预可部分上调nrf2的蛋白表达(p0.05)。4.肾组织炎症状态的变化。(1)检测肾组织匀浆中白细胞活化的标志物mpo和前炎症因子il-1β,评估肾脏的炎症状态,发现造影剂肾损伤后肾组织中的mpo活性及il-1β的表达均显著升高(p0.05);egcg干预能明显降低mpo活性及il-1β的表达,改善损伤肾组织的炎性状态(P0.05)。(2)进一步检测NLRP3/IL-lβ炎性小体信号通路在造影剂肾损伤和EGCG保护作用中的变化,发现造影剂肾损伤后肾组织NLRP3的表达显著升高(P0.05),EGCG干预可明显下调NLRP3的含量(P0.05)。5.HO-1在EGCG抗氧化和抗炎症中的重要性。为探讨EGCG抗氧化和抗炎症作用中的关键信号分子,分别采用两种HO-1的活性抑制剂ZnPP和SnPP进行干预,观察HO-1受抑制后EGCG对造影剂肾损伤保护作用的变化,发现ZnPP+EGCG+CM组或SnPP+EGCG+CM组与HO-1未抑制组(CM+EGCG组)比较,血Cr、BUN均明显升高,HO-1抑制后抵消了EGCG对造影剂肾损伤的保护作用。进一步研究发现ZnPP+EGCG+CM组较HO-1未抑制组肾组织的MDA、MPO、IL-1β水平升高,SOD活性降低,肾组织NLRP3表达增多(P0.05),与CM组比较无统计学差异(P0.05),提示HO-1在EGCG的抗氧化应激和抗炎性通路中发挥了重要性。结论:EGCG围损伤期静脉用药可减轻造影剂肾损伤。EGCG可通过上调Nrf2/HO-1抗氧化通路、下调NLRP3/IL-1β炎症通路改善肾组织的氧化应激和炎症水平,其中HO-1是EGCG对造影剂肾损伤保护作用的关键分子靶点。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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