LeftyA拮抗TGF-β1诱导肾小管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶对肾纤维化的影响及机制

发布时间：2018-12-11 05:23

【摘要】：背景肾积水等所致肾纤维化,尤其是肾小管间质纤维化(TIF),几乎是所有的慢性进展性肾脏疾病的共同结局,同时肾纤维化也是判断肾功能预后的重要指标之一。已有研究表明,TGF-β1是一种功能强大的促进纤维变性的纤维生成因子,而LeftyA及其相关蛋白在胚胎发育中能够抑制TGF-β1信号传递。本课题组前期研究发现：肾重度积水患者的肾组织中,LeftyA基因极低表达。据此,我们推断LeftyA蛋白可能具有抗肾脏纤维化的功能。在本研究中,通过构建pcDNA3.str/Neo(+)-TGF-β1真核表达载体,稳定转染人肾小管上皮细胞(HK-2)使之高表达TGF-β1蛋白,从而诱导人肾小管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶2和9(MMP-2/9),而后者导致肾小管上皮肌成纤维母细胞转化(EMT)并对肾小管基膜造成损伤,此公认为肾纤维化的重要机制之一。本研究旨在明确：LeftyA能否拮抗TGF-β1诱导肾小管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶,进而减轻肾纤维化。第一部分人TGF-β1基因转染诱导的HK-2细胞MMP-2/9表达变化目的：通过构建pcDNA3.str/Neo(+)-TGF-β1真核表达载体,建立TGF-β1稳定表达细胞系,探讨转染人TGF-β1基因对细胞分泌MMP2/9的影响。方法：以载有TGF-β1的克隆载体pM19-TSimple为模板,PCR反应获得TGF-β1编码区DNA,酶切和连接插入pcDNA3.str/Neo(+)构建TGF-β1真核表达载体,LipofactamineTM2000将此重组质粒转染入HK-2细胞,新霉素(neomycin)筛选,构建TGF-β1稳定表达细胞系；RT-PCR及Western blot检测此稳定转染细胞系中mRNA及TGF-β1蛋白的表达,Western blot检测MMP-2/9蛋白的表达。结果：PCR扩增出TGF-β1编码区片段,酶切、琼脂糖电泳及基因测序均证实pcDNA3.str/Neo(+)-TGF-β1真核表达载体成功构建；新霉素(neomycin)筛选得到高表达TGF-β1蛋白的HK-2细胞系；RT-PCR和Western blot证实此细胞系高表达mRNA及TGF-β1蛋白。Vestern blot证实MMP-2/9表达明显增强。结论：pcDNA3.str/Neo(+)-TGF-β1真核表达载体成功构建,TGF-β1稳定表达细胞系建立,Western blot证实MMP-2/9表达明显增强,为研究LeftyA蛋白抗肾纤维化奠定了基础。第二部分LeftyA拮抗TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞分泌MMP-2/9对肾纤维化的影响目的：探讨在人肾小管上皮细胞中LeftyA拮抗TGF-β1诱导分泌基质金属蛋白酶对肾纤维化的影响。方法：通过转染HK-2细胞,建立TGF-β1、LeftyA+TGF-β1稳定表达细胞系,分别观察细胞形态,检测正常HK-2细胞、TGF-β1稳定表达细胞系和LeftyA+TGF-β1稳定表达细胞系中的MMP-2/9蛋白、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及相应mRNA的表达变化。结果：光镜显示：稳定转染TGF-β1的HK-2细胞呈长梭形,LeftyA转染TGF-β1稳定表达细胞系,可显著抑制这种形态改变。与正常HK-2细胞相比,稳定转染TGF-β1细胞内E-cadherin表达下调,α-SMA与MMP-2/9表达明显上调。在LeftyA转染TGF-β1稳定表达细胞系中,LeftyA蛋白上调表达可显著抑制TGF-β1诱导HK-2细胞内E-cadherin的下调表达(P0.05),并逆转α-SMA和MMP-2、9上调表达(P0.05)。结论：在肾小管上皮细胞中,TGF-β1诱导分泌MMP2/9,而LeftyA可拮抗此事件,减轻MMP-2/9对肾小管基底膜的损伤。LeftyA通过抑制TGF-β1经MMP-2/9介导的上皮肌成纤维母细胞转分化(EMT),从而减轻肾纤维化,发挥抗纤维化作用。第三部分LeftyA拮抗TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞分泌MMP-2/9机制探讨目的：探讨在人肾小管上皮细胞中LeftyA拮抗TGF-β1诱导分泌基质金属蛋白酶2/9的机制。方法：在HK-2细胞中分别稳定转染pcDNA3.str-TGF-β1与pcDNA3.str-TGF-β1+pcDNA3.1-Lefty A, Western blot分别检测3种细胞p-Smad3蛋白,p-JNK蛋白、p-ERK及p-p38MAPK蛋白表达的变化。结果：稳定转染pcDNA3.str-TGF-β1即可诱导p-Smad3、p-JNK、p-ERK以及p-p38MAPK蛋白激活表达。在稳定转染pcDNA3.str-TGF-β1的HK-2细胞系中,转染pcDNA3.1-LeftyA, Lefty A蛋白表达上调,抑制TGF-β1对Smad3、JNK、ERK与p38MAPK的激活。结论：在人肾小管上皮细胞中,LeftyA蛋白通过抑制Smad信号通路及JNK、ERK与p38MAPK信号通路拮抗TGF-β1诱导分泌基质金属蛋白酶2/9。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692

【参考文献】