局灶节段肾小球硬化的转录组学研究

发布时间：2019-01-02 13:22

【摘要】：局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)作为导致成人及儿童激素抵抗肾病综合征和肾功能衰竭最常见的原因之一,其病理生理机制仍不清楚。FSGS诊断依靠肾活检,其病理特征包括局灶节段性肾小球硬化,和足突的弥漫融合。然而,由于病变小球往往位于皮质深部接近髓质处,肾活检易遗漏,给FSGS的诊断带来一定困难。FSGS根据病因可分为原发性、继发性和家族性。家族性FSGS(Familial FSGS,FFSGS)也叫遗传性FSGS,占非继发性FSGS 9%左右。FSGS患者临床通常表现为大量蛋白尿,部分表现为肾病综合征范围的蛋白尿,对这部分患者治疗主要包括激素和免疫抑制剂,根据对足量激素的疗效可分为激素敏感、激素依赖和激素抵抗,激素依赖和抵抗患者容易进展至终末期肾脏病(ESRD)。转录组学是从RNA水平研究基因表达情况的研究方法。以往报道关于FSGS的转录水平的研究,采用材料多来自肾组织(包括肾小球和小管间质)的石蜡标本,由于FSGS为足细胞疾病,纳入肾小管和间质将造成结果偏差,此外石蜡组织中RNA的降解难以避免。因此,本研究在倒置显微镜下分离FSGS患者活检肾组织中的肾小球,最大限度的保持患者肾小球转录本的完整性。并通过高通量的Microarray分析方法直接对患者肾小球的转录本进行研究,以期从转录水平上,发现FSGS的发病机制。此外,本研究不仅入选原发性FSGS患者,还入选携带基因突变的遗传性FSGS患者和激素抵抗FSGS患者,将从不同角度,全面探讨FSGS的转录组表达差异,从而深入了解FSGS的致病机制。本研究第一部分纳入6例原发性FSGS患者,5例MCD患者,两组患者接受肾穿刺时均未接受激素和/或免疫抑制剂治疗,且所有入组患者都表现为激素敏感,排除治疗反应的差异对Microarray结果的影响。倒置显微镜下极细尖头镊分离患者肾活检皮质组织中肾小球,对两组患者肾小球的转录本进行microarray分析,重点对两种疾病的基因表达的差异进行了详尽的分析。microarray结果提示,fsgs与mcd患者肾小球转录本相比:参与生殖细胞形成、泛素化过程、蛋白刺激反应、肌肉收缩的调节、细胞增生和骨骼系统发育的基因高表达;而参与合成和分解代谢过程、细胞内转运、氧化还原反应、细胞定位的形成的基因低表达。并通过rt-pcr方法在另外7例fsgs与7例mcd患者肾小球转录本中验证相关基因的表达趋势与microarray结果一致。并发现膜金属肽链内钛酶(membranemetalloendopeptidase,mme)蛋白在fsgs患者肾小球中的表达量明显低于mcd患者,提示mme可作为潜在的区别fsgs、mcd的生物学标志物,同时提示mme可能参与fsgs的发生。除了原发性fsgs,以往研究发现一部分家族性fsgs患者为足细胞相关分子突变引起,提示与原发性fsgs存在不同机制。本课题组前期研究在汉族人fsgs家系中成功发现col4a3基因杂合突变可引起汉族人家族性fsgs。本研究第二部分,纳入3例携带iv型胶原α3链(col4a3)基因突变的ffsgs患者(c1616y,g801r,l737h)和5例mcd患者。通过对其临床资料的回顾性整理统计,观察ffsgs与mcd两组患者临床特点的差别,结果显示与mcd相比,携带col4a3基因突变ffsgs患者发病较早,较少发生肾病综合征,合并镜下血尿较多,尿蛋白水平较低,血浆白蛋白水平较高,肾活检时ffsgs患者肾小球滤过率较低。对两组患者肾小球的转录本进行microarray分析,结果显示携带col4a3基因突变的ffsgs患者肾小球转录本与mcd患者肾小球转录本相比,参与细胞间及细胞表面受体信号传导、神经信号传递、认知、感官直觉、g蛋白偶联受体信号通路的基因呈现高表达;而参与合成及分解代谢、蛋白质裂解及泛素化过程,和细胞内转运过程的基因呈现低表达。挑选前6位上调,和前6位下调表达的基因,采用rt-pcr方法在相同患者肾组织转录本中验证相关基因的表达趋势,结果显示相关基因表达趋势与microarray结果一致。gbm主要由iv型胶原(col4a3)组成,在临床工作中,一部分fsgs患者活检肾组织gbm在em下呈节段性改变,但该病理改变的机制以及临床意义不明。此外,先前研究本课题组发现,col4a3基因杂合突变携带者可见gbm节段性变薄,与典型薄基底膜肾病(tbmn)以及as的电镜下特征不同。因此我们通过分析合并gbm节段变薄的fsgs患者与gbm无病变的fsgs患者的临床、病理数据,以期发现gbm节段变薄对患者临床、病理以及预后的影响。通过对63例合并gbm局灶变薄的fsgs患者与60例gbm无病变的fsgs患者临床资料的比较分析,结果显示与gbm无病变的fsgs患者相比,合并gbm局灶变薄的fsgs患者尿蛋白水平明显较高,血浆白蛋白水平较低,肾小球滤过率较低,且血红蛋白水平较低。两组患者肾病综合征、血尿的比例,病理表现以及治疗反应未见明显差异。fsgs的主要治疗包括激素和免疫抑制剂,根据以往数据显示,大约1/3fsgs患者对激素治疗反应差,但具体机制不明。本研究第三部分通过纳入6例临床表现为激素敏感肾病综合征(ssns)的原发性fsgs患者,3例临床表现为激素抵抗肾病综合征(srns)的原发性fsgs患者,对两组患者肾小球的转录本进行microarray分析,观察两组患者基因表达的差异。结果显示与fsgs-ssns患者肾小球转录本相比,fsgs-srns患者肾小球转录本中:参与细胞内氨基酸及其衍生物代谢,离子转运过程的基因呈现高表达;而参与人体器官组织形成、dna依赖的转录过程调节、mapk活性的负向调控的基因呈现低表达。rt-pcr验证结果显示相关基因的表达趋势与microarray结果一致。免疫组织化学结果显示stra6(stimulatedbyretinoicacidgene6homolog)基因编码蛋白在fsgs-srns患者肾小球中的表达量明显低于fsgs-ssns患者。提示stra6的低表达可能与srns的fsgs发生有关,因此,我们提出stra6可作为鉴别fsgs治疗反应的潜在的生物学标志物,同时提示stra6可能参与fsgs-srns的发生。综上所述,本研究入选临床特征为ssns的原发性fsgs患者,遗传性fsgs患者(携带col4a3杂合突变)和srns的fsgs患者,入选mcd患者作为对照组,通过转录组学分析,得到了fsgs的转录组表达图谱。结果显示:ssns患者,遗传性fsgs患者与mcd患者肾小球转录本表达差异明显。与ssns患者相比,srns患者肾小球转录本差异明显。差异表达的基因中,参与生殖细胞形成、泛素化过程、合成和分解代谢过程等的基因在ssns和mcd患者中表达差异明显;参与细胞间及细胞表面受体信号传导、神经信号传递、认知、感官直觉、G蛋白偶联受体信号通路的基因;参与合成及分解代谢、蛋白质裂解及泛素化过程,和细胞内转运过程的基因,在遗传性FSGS和MCD患者中表达差异明显;参与细胞内氨基酸及其衍生物代谢、离子转运过程、人体器官组织形成、DNA依赖的转录过程调节等的基因在SRNS与SSNS患者中表达差异明显。MME基因及其编码蛋白在FSGS患者肾小球中的表达量明显低于MCD患者,提示MME可作为潜在的区别FSGS、MCD的生物学标志物,同时提示MME可能参与FSGS的发生。STRA6基因及其编码蛋白在SRNS的FSGS患者肾小球中的表达量明显低于SSNS的FSGS患者。提示STRA6可作为鉴别FSGS治疗反应的潜在的生物学标志物,同时提示STRA6可能参与FSGS-SRNS的发生我们发现一部分散发性FSGS患者也表现为GBM节段性变薄,进一步分析合并与不合并GBM节段变薄的FSGS患者的临床、病理和预后差异,发现合并GBM节段变薄的FSGS患者肾小球滤过率较低,尿蛋白水平较高,血浆白蛋白水平较低,提示这部分患者临床表现较重。
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【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692.6

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