MUC4在膀胱癌中的表达及其启动子驱动HSV-tk腺病毒靶向杀伤膀胱癌细胞的研究

发布时间：2019-01-04 14:15

【摘要】：膀胱癌是我国泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，其中移行细胞癌占膀胱癌90%以上。膀胱癌的发生进展是复杂的、多因素、多步骤的病理变化过程，既有内在的遗传因素，又有外在的环境因素，具有异源性、多中心、易复发及复发后恶性度增加的特点。目前大多数膀胱癌病因学研究集中于基因的改变。正常膀胱细胞恶变始于细胞DNA的改变，原癌基因突变后变为癌基因后，使细胞无节制的分裂，导致膀胱癌复发和进展。膀胱癌发生的另一个重要分子机制是编码调节细胞生长、DNA修复或凋亡的蛋白抑癌基因失活，使DNA受损的细胞不发生凋亡，导致细胞生长失控。此外，，某些编码生长因子或其受体的正常基因的扩增或过表达，也与膀胱癌的发生进展相关。目前膀胱癌治疗以手术为主，辅以术后膀胱灌注化疗，但术后高复发率严重影响患者的生活质量。因此，研究膀胱癌的发生、发展、侵袭、转移等分子机制，对探寻膀胱癌真正理想治疗措施将具有十分重要意义。目前研究表明，膀胱癌的复发、浸润和转移由肿瘤细胞多种生物学行为决定，其中肿瘤细胞的粘附能力在肿瘤的复发、浸润及转移进展中具有重要作用。研究发现黏蛋白（mucin，MUC）与多种肿瘤的复发、浸润、转移有关。MUC4是黏蛋白家族中的重要一员，研究发现其具有潜在癌基因特性，可作为部分肿瘤发展进程中的标记物。目前研究表明，MUC4在胰腺癌、卵巢癌、食管鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤中均存在异常表达，可作为它们发展进程中的标记物。同时，研究发现MUC4可通过多种机制参与肿瘤发生、发展，如细胞间粘附、细胞信号转导、细胞凋亡等。近年来研究发现，MUC1与泌尿生殖肿瘤密切相关。运用单克隆抗体检测膀胱癌组织，发现癌组织样本中MUC1表达率较非癌组织明显增高，证实MUC1在膀胱癌组织中异常高表达，可能是膀胱恶性演进和淋巴结转移的标志。同时还有MUC1基因在前列腺癌和肾癌中均存在异常表达，且肾癌中其表达高低与其转移及预后相关的研究报道。MUC1基因与泌尿生殖肿瘤，特别是与膀胱癌的发生和发展密切相关，我们课题组在前期应用二代基因测序技术对膀胱肿瘤外显子捕获的研究中发现：MUC4基因在膀胱肿瘤组织中高表达。目前国内外关于MUC4基因在膀胱癌中的研究极少，而同为黏蛋白家族的重要成员MUC4是否与膀胱癌密切相关？因此，本课题进行了以下两部分的实验研究。第一部分：膀胱癌细胞株及膀胱癌组织中MUC4基因的表达目的：探讨MUC4基因在HT1376、T24膀胱癌细胞株、膀胱癌组织、癌旁组织及正常膀胱粘膜组织中的表达情况。方法：运用荧光定量PCR (QT-PCR)和Western blot方法检测HT1376、T24两种膀胱癌细胞株及正常膀胱粘膜上皮细胞株中MUC4基因mRNA与蛋白的表达。应用QT-PCR检测9对匹配的膀胱癌、癌旁组织及正常膀胱粘膜组织，共27例标本中MUC4mRNA的表达，其中膀胱癌组织均为移行细胞癌，病理证实浅表性6例，浸润性3例。应用免疫组化检测64例膀胱组织（癌组织34例，癌旁组织20例，正常组织10例）中MUC4蛋白表达情况。结果：通过QT-PCR检测MUC4的mRNA表达：在HT1376、T24细胞株及正常膀胱粘膜上皮细胞株中其相对表达量分别为13.746±0.309、3.501±0.286、0.914±0.100；在9对匹配组织中，其在癌、癌旁及正常膀胱粘膜中相对表达量分别为10.673±2.797、2.679±0.488、0.610±0.294。与正常膀胱粘膜相比，MUC4的mRNA在膀胱癌细胞株及膀胱癌组织中呈高表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与癌旁组织相比，MUC4mRNA在膀胱癌组织中表达量高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）；其在癌旁组织中表达高于正常膀胱粘膜，差异具有统计学意义（P＜0.05）。通过Western blotting检测，MUC4蛋白在HT1376、T24膀胱癌细胞株中呈高表达，在HT1376细胞中表达量高于T24细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。34例膀胱癌组织中，免疫组化检测显示MUC4蛋白阳性表达27例，阳性率为79.4%；20例癌旁组织中MUC4阳性表达10例，阳性率为50.0%；10例正常组织中MUC4阳性表达3例，阳性率30.0%，组间差异有统计学意义(P0.05)；癌旁组织和正常组织中MUC4蛋白表达的结果与mRNA的表达情况相似。MUC4蛋白表达与膀胱癌临床分期无关，与膀胱癌病理分级相关（P＜0.05）。结论：MUC4基因在HT1376、T24膀胱癌细胞株、膀胱癌组织中呈高表达；初步认为MUC4蛋白表达程度与膀胱癌病理分级相关，提示MUC4基因可能作为高级别膀胱癌的候选靶基因，在膀胱癌进展中发挥重要作用。第二部分：MUC4启动子驱动HSV-tk腺病毒对膀胱癌细胞靶向杀伤作用目的：探讨MUC4启动子驱动HSV-tk腺病毒靶向杀伤膀胱癌细胞并引起细胞的凋亡。方法：克隆MUC4启动子活性序列，利用重组荧光素酶检测系统检测其在HT-1376和T24两种膀胱癌细胞中的转录活性，以腺病毒系统为载体，构建MUC4启动子驱动下的HSV-tk重组腺病毒，激活MUC4启动子信号调控的转录活性，驱动下游HSV-tk基因，与GCV联合，检测其对上述两种膀胱癌细胞的细胞毒作用。结果：通过构建稳定表达MUC4基因ATG上游启动子区域的重组腺病毒质粒，在HT-1376和T24膀胱癌细胞中具有强转录活性，而在对照组HFL1肺成纤维细胞中几乎无转录活性，提示MUC4启动子对其下游HSV-tk基因表达的转录调控具有肿瘤细胞特异性。本研究结果表明MUC4启动子驱动下的HSV-tk重组腺病毒与GCV联合能够诱导HT-1376和T24膀胱癌细胞凋亡，产生特异性靶向细胞毒作用。结论：通过激活MUC4启动子信号调控的转录活性，在MUC4启动子驱动下的HSV-tk重组腺病毒联合GCV对和HT-137和T24膀胱癌细胞具有较强靶向杀伤作用。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.14

【参考文献】