miR-34a调控作用下由miR-181a介导LEF1调控前列腺癌EMT及侵袭相关机制的研究

发布时间：2019-01-11 14:27

【摘要】：第一部分：前列腺癌细胞系中与LEF1相关miRNAs高通量筛选及验证 目的筛选并验证与LEF1相关的miRNAs表达变化。 方法利用3种前列腺癌细胞系LNCaP (LEF1低表达),]NCaP-AI (LEF1高表达)和LNCaP-AIshLEF1(LEF1低表达)做miRNA基因芯片分析。利用TaqMan探针实时定量PCR技木验证miRNA基因芯片结果。 结果在miRNA基因芯片所覆盖的687个miRNAs中,通过LNCaP-AI/LNCaP和LNCaP-AI/LNCaP-AILEF1shRNA两组数据做聚类分析发现共有18个miRNAs有超过2倍的表达水平差异,其中LNCaP-AI/LNCaP组中miR-34a表达下调了6.97倍,而miR-181a上调了12.36倍。利用TaqMan探针实时定量PCR技术验证表达上调及下调变化排在前9的miRNAs,发现miR-34a及miR-181a实时定量PCR结果与基因芯片结果一致,而且表达变化差异分别位于下调和上调中最高。 结论在前列腺癌细胞系中,miR-34a与LEF1基因表达负相关,miR-181a与LEF1基因表达正相关,故选择miR-34a和miR-181a做进一步研究。 第二部分：miR-34a及miR-181a对体外前列腺癌EMT及侵袭功能研究 目的体外实验探讨miR-34a及miR-181a调控前列腺癌细胞EMT及侵袭功能 方法利用化学合成的miR-34a或miR-181a模拟物及抑制物模拟过表达或低表达特定microRNA;选择E-cadherin及N-cadherin作为EMT标志物,Western-blot检测其蛋白表达水平；BD基质胶侵袭实验及transwell小室检测侵袭及迁移能力。 结果在LNCaP-AI和C4-2B细胞中,miR-34a抑制EMT及侵袭能力,而miR-181a抑制物抑制EMT及侵袭能力；在LNCaP和C4-2B细胞中,miR-34a抑制物促进EMT及侵袭能力,而miR-181a促进EMT及侵袭能力。 结论前列腺癌中,miR-34a抑制EMT及侵袭能力,miR-181a促进EMT及侵袭能力。 第三部分：LEF1与m i R-34a及miR-181a作用机制研究 目的探索miR-34a、LEF1和miR-181a三者之间调控作用关系 方法TaqMan实时定量PCR及Western-blot检测基因及蛋白表达水平变化；双荧光素酶报告基因实验验证miR-34a特异性结合LEF13'UTR;利用ChIP方法分析LEF1对miR-181a启动子区域调控作用。 结果miR-34a通过靶向结合LEF13'UTR在mRNA水平及蛋白水平负向调控LEF1,miR-34a在mRNA水平同时负向调控LEF1及miR-181a。LEF1在转录水平靶向结合has-miR-181a-2上游启动子区域促进miR-181a表达。 结论miR-34a-LEF1-miR-181a调控轴在前列腺癌EMT及侵袭中起到重要调节作用。
[Abstract]:Part I: high throughput screening and validation of miRNAs associated with LEF1 in prostate cancer cell lines; objective to screen and verify the changes of miRNAs expression associated with LEF1. Methods three prostate cancer cell lines, LNCaP (low expression of LEF1), NCaP-AI (high expression of LEF1) and LNCaP-AIshLEF1 (low expression of LEF1), were used for miRNA microarray analysis. The results of miRNA gene chip were verified by real time quantitative PCR with TaqMan probe. Results among the 687 miRNAs covered by miRNA gene chip, there were more than 2 times difference in expression level of 18 miRNAs by cluster analysis of LNCaP-AI/LNCaP and LNCaP-AI/LNCaP-AILEF1shRNA data. In LNCaP-AI/LNCaP group, the expression of miR-34a decreased by 6.97 times, and miR-181a increased by 12.36 times. TaqMan probe real-time quantitative PCR technique was used to verify that the miR-34a and miR-181a real-time quantitative PCR results were consistent with the gene chip results, and the difference was the highest in down-regulation and upregulation, respectively. Conclusion there is a negative correlation between miR-34a and LEF1 gene expression in prostate cancer cell line, and a positive correlation between miR-181a and LEF1 gene expression. Therefore, miR-34a and miR-181a are selected for further study. Part two: study on the function of miR-34a and miR-181a on EMT and invasion of prostate cancer in vitro objective to investigate the effect of miR-34a and miR-181a on the regulation of EMT and invasive function of prostate cancer cells by chemical synthesis in vitro MiR-34a or miR-181a mimics and their inhibitors mimic overexpression or low expression of specific microRNA; E-cadherin and N-cadherin were selected as EMT markers and their protein expression levels were detected by Western-blot. Invasion and migration ability were detected by BD matrix invasion assay and transwell chamber. Results in LNCaP-AI and C4-2B cells, miR-34a inhibited EMT and invasion, while miR-181a inhibited EMT and invasion. In LNCaP and C4-2B cells, miR-34a inhibitor promoted EMT and invasion ability, while miR-181a enhanced EMT and invasion ability. Conclusion in prostate cancer, miR-34a inhibits EMT and invasiveness, miR-181a promotes EMT and invasiveness. Part three: study on the interaction Mechanism of LEF1 with MiR-34a and miR-181a objective to explore the regulatory relationship between miR-34a,LEF1 and miR-181a; TaqMan real-time quantitative PCR and Western-blot were used to detect the changes of gene and protein expression levels. Double luciferase reporter gene experiment verified that miR-34a specifically combined with LEF13'UTR; to analyze the role of LEF1 in the regulation of miR-181a promoter region by ChIP method. Results miR-34a negatively regulated LEF1, at mRNA level and protein level by targeting LEF13'UTR. MiR-34a negatively regulates both LEF1 and miR-181a.LEF1 at the mRNA level at the transcriptional level targeting the upstream promoter of has-miR-181a-2 to promote miR-181a expression. Conclusion the miR-34a-LEF1-miR-181a regulatory axis plays an important role in the regulation of EMT and invasion of prostate cancer.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

【共引文献】

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本文编号：2407235