MiR-152下调导致DNA甲基化促进膀胱癌发生发展的机制研究

发布时间：2019-01-22 15:08

【摘要】：【研究背景】：膀胱癌是现阶段全世界泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一(1)，是一种直接威胁患者生存的疾病。Prakin M报道了世界范围内膀胱癌的发病率居常见肿瘤的第9位，病死率居第13位(2)。近年来，随便工业污染的愈发严重以及诊疗手段的提高，膀胱癌的发病率以及诊出率呈现逐年上升的趋势。有学者统计分析得出，从1985年到2005年，膀胱癌的新确诊人数增加了将近50%(3)，已经成为了研究影响人们生活健康状况的常见恶性肿瘤之一。目前，对膀胱癌的诊断、治疗等诸多方面尚且缺乏统一的标准，使得对其的诊疗仍然存在进步的空间。膀胱癌中有80%左右的膀胱癌为浅表型肿瘤，目前的主要方式是经尿道电切（TURBt）；已经有文献报道，TURBt治疗膀胱癌术后会有10%-65%的患者在1年内复发；超过24%-84%的患者在5年内复发；有将近20%的患者复发后，肿瘤的恶性程度会增加；10%的患者最终会发展为侵润性癌或者转移；同样，有些分化良好的肿瘤会在5年内发生进展为侵润型肿瘤，并发生转移(3)。侵润型膀胱癌的治疗方式以手术切除为主(4)，但创伤大、并发症多、5年生存率低（54.5%-68%）是手术治疗的缺点(3.4)，且易复发、易转移。这一系列的原因使得膀胱癌的诊疗仍然是目前泌尿系肿瘤的难点。到目前为止，仍没有发现膀胱癌有关的特异性生物标记物和治疗靶点，且形成机制尚未完全阐明，这使得膀胱癌的治疗更加困难。所以，进一步的研究膀胱癌的发病分子机制，具有十分重要的科学意义。膀胱癌的形成受到多种不同作用因素的共同作用：包括：①相关基因发生突变；②致癌基因的表达增加或者过表达；③全身因素；④肿瘤与周围基质间的各自作用；⑤尿路上皮细胞所处微环境的改变；⑥外界致癌物质的刺激(5)；在致癌物质的刺激或者抑癌基因表达下降的情况下，正常膀胱细胞DNA产生损伤，导致了膀胱肿瘤的生成和发展。在这个过程中，致癌基因的激活以及抑癌基因的失活，起到重要作用(6)。目前，研究的热点主要集中在膀胱癌发生进展中抑癌基因的作用上。抑癌基因的突变、失活、丢失，都会导致膀胱癌。因此，导入野生型抑癌基因以修补缺陷，使得肿瘤抑癌基因的功能得以恢复，是膀胱癌的治疗方法之一(7)。抑癌基因是细胞分化增殖过程中发挥重要作用的调节因子之一，在正常细胞中发挥了阻滞细胞异常增殖，促进细胞分化的功能。抑癌基因如果发生突变或者失活，可以趋向细胞的异常分裂增殖，进而导致肿瘤发生（8.9.10）。 MicroRNAs（miRNA）亦称微小RNA，是一种约由21-23个核苷酸组成的单链非编码小分子RNA。细胞内的miRNA是独立的编码基因，是机体遗传信息的重要组成部分(11)。MiRNA由RNA聚合酶II转录成为miRNA初级转录体，随后被酶在核内即切割形成miRNA前体，而后被转运至细胞胞浆中加工形成成熟的miRNA以碱基互补的形式与同源mRNA互补配对，从而诱导miRNA的切割降解、翻译或者其他形式调控抑癌基因的表达，这就是转录后的基因表达的调控过程(12)。目前，研究发现它主要通过与靶基因的miRNA3’-UTR区域（mRNA的3’的非翻译区）相互补充配对，从而发挥沉默或者激活特定靶基因的作用(13)。越来越多的研究证据表明，miRNAs是普遍广泛存在于各种动植物以及病毒中，在人类等哺乳类动物中有超过30%的基因是受到miRNAs调控的。研究结果显示，miRNA在生物体的发育、增殖、分化或者凋亡中，特别是肿瘤的发生发展等方面发挥着重要的调控作用。随着研究的不断深入，越来越多的miRNAs被发现和报道(14)。有很多学者认为，miRNAs的改变在人类的肿瘤的病理生理发展过程中起到了关键性作用，甚至有人提出miRNAs的异常是最重要的肿瘤发生发展的原因。通过对已经发表的文献进行回顾，我们发现miRNAs的异常表达存在于许多肿瘤中，包括：泌尿系肿瘤、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤以及白血病(15)。MiRNAs通过调控下游靶基因，在肿瘤的发生发展中发挥了至关重要的致癌或抑癌基因的功能(16)。在我们的前期研究中，通过MicroRNA芯片技术检测了膀胱癌组织以及癌旁组织中miRNA的异常表达，发生在膀胱癌组织中，miR-152的表达是明显降低的，进一步通过Real-time PCR实验检测证实：与正常组织相比，miR-152是膀胱癌细胞中下调最明显的miRNA之一，所以我们推断：miR-152可能在膀胱癌的发生发展中起到了抑癌基因的作用。然而，miR-152在膀胱癌中的具体功能尚无研究报道，因此，有必要对miR-152在膀胱癌中的作用机制进行研究。【目的】: 1．研究miR-152在膀胱癌的发生发展中的作用，确定miR-152是膀胱癌发生进程中是否起到了重要的抑癌基因作用，是否由于miR-152的缺失导致了膀胱癌的发生以及发展。 2．确定miR-152的下调，是否导致了DNA甲基化的程度上调。是否DNA甲基化程度下降后，miR-152的表达是否会升高。 3．鉴定miR-152调控的下游靶基因，分析并提出由于miR-152缺失导致的膀胱癌发生、发展的作用途径。【材料和方法】: 1.培养膀胱癌细胞和人类膀胱上皮永生化细胞，检测miR-152的表达情况。通过Real-time检测膀胱癌细胞株T24和人类膀胱上皮永生化细胞Sv-huc-1中miR-152的表达情况。 2.观察miR-152对膀胱癌细胞和人类膀胱上皮永生化细胞的生物学行为影响。转染miR-152mimics到T24细胞中，转染miR-152inhibitor到Sv-huc-1中，分别通过细胞计数、细胞集落形成和Real-time PCR检测膀胱癌细胞株的细胞增殖能力。 3.鉴定miR-152调控的下游靶基因。靶基因预测软件TargetScans预测miR-152在膀胱癌中的潜在靶基因是DNMT1。分别构建含有DNMT1基因的3’端非编码区域序列DNMT13’-UTR（DNMT1-WT）和突变序列DNMT13’-UT（RDNMT1-MU）的荧光素酶报道，检测miR-152的作用区域。转染miR-152后，采用Real-time PCR和Western blot检测miR-152和潜在靶基因DNMT1蛋白的表达裱花，进一步通过Real-time PCR检测靶基因DNMT1下游基因的表达变化，进而阐明miR-152以及其靶基因在膀胱癌中的可能的作用机理。【结果】: 1. Real-time PCR检测结果表明，在人类膀胱上皮永生化细胞Sv-huc-1中miR-152是高表达的；同时，DNA甲基化程度很低。而在膀胱癌细胞株T24中，miR-152是低表达的，同时DNA甲基化程度很高（P0.01）。 2.细胞计算实验和细胞集落形成实验结果表明，miR-152是显著抑制膀胱癌细胞株T24的增殖的（P0.01）。 3. TargetScans软件预测DNMT1可能是miR-152的潜在靶基因，DNMT1基因3’非转录区（3’-UTR）包含了miR-152的互补结合位点。荧光素酶报告基因分析结果表明：在转染miR-152和DNMT1-WT的荧光报告载体的荧光强度受到了显著抑制（P0.001），而突变型DNMT1（DNMT1-MU）基因的荧光报告载体的荧光强度基本不受影响。 4.转染miR-152模拟剂后，采用Western blot以及Real-time PCR检测DNMT1的表达情况，以检测DNA甲基化程度。我们发现DNMT1酶表达受到抑制。转染miR-152后，，采用Real-time PCR检测受DNA甲基化调控的下游基因。我们发现HoxA9的表达是下调的。以此我们推测，HoxA9是受DNA甲基化调控的下游靶基因。【结论】: 1：MicroRNA-152在膀胱细胞中，是高表达；在膀胱癌细胞中是低表达的。在正常膀胱细胞中，DNA甲基化的程度很低。随着癌变的发生，DNA甲基化的程度，有所增加。 2：MiR-152表达改变后，作用于DNA的3’-UTR区域，导致了DNA发生甲基化，或DNA甲基化程度增加。 3：在膀胱癌的发生发展过程中，miR-152起到了抑癌基因的作用。 4：在膀胱癌中，HoxA9是受DNA甲基化调控的下游靶基因之一。
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【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.14

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