软脂酸对肾小管上皮细胞TLR4表达的影响

发布时间：2019-01-30 08:40

【摘要】：研究目的检测软脂酸（PA）对肾小管上皮细胞Toll样受体4（TLR4）及其下游炎症因子IL-6和TNF-ɑ表达的影响，探讨游离脂肪酸（FFAs）在引发肾脏微炎症反应的相关作用机制。 实验方法用含有软脂酸浓度为（0μ mol/L、125μ mol/L、250μ mol/L、500μ mol/L）的DMEM培养液对正常的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）进行干预。①于干预24小时后观察NRK-52E的形态学的变化；②采用MTT法检测不同浓度的软脂酸干预12h,24h后NRK-52E的增殖情况；③相同条件下培养细胞12h，，24h，应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)检测肾小管上皮细胞TLR4mRNA水平；④用流式细胞术仪(flow cytometry，FC)检测软脂酸干预24小时后NRK-52E表面TLR4的蛋白水平；⑤采用酶联免疫吸附试验检测软脂酸作用12h，24h后不同浓度组上清液中白介素-6（IL-6）与肿瘤坏死因子-α （TNF-ɑ）的表达情况。 主要结果 1.NRK-52E细胞形态正常NRK-52E细胞为类圆形的贴壁细胞,铺满、融合后细胞呈铺路石状贴壁生长。经24小时不同浓度软脂酸干预后,由紧密连接的类圆形细胞拉长为连接松散的梭形细胞,其中500μ mol/L浓度的软脂酸干预后细胞变化尤为明显。 2.MTT检测细胞增殖细胞处理12h，24h终点时：d-BSA组与空白对照组相比，无统计学差异（p0.05），说明d-BSA作为软脂酸与NRK-52E细胞结合的载体，对NRK-52E细胞的增值不产生有意义的影响；各软脂酸组与空白对照组比较，OD值明显减小，且有显著的统计学差异(P0.01)；三组不同浓度软脂酸组之间两两比较，OD值随着软脂酸浓度的增加逐渐减小，且各组间差异均有统计学意义(P0.05)。相同浓度组不同时间段比较：24小时较12小时OD值有所降低，且各组均有统计学差异(P0.05)。 3.PCR检测结果细胞处理12小时结果：不同组之间细胞内TLR4的mRNA表达量总体有差别，差异有统计学意义（P＜0.05）；PA125μ mol/L组与d-BSA对照组相比TLR4的mRNA表达上调，且差异有统计学意义（P＜0.05）；PA250μ mol/L组与d-BSA对照组及PA125μ mol/L组相比TLR4的mRNA表达上调，但与PA125μmol/L组之间差异无统计学意义，可能在软脂酸干预的早期，这两组浓度软脂酸不足以引起TLR4的mRNA的差异性表达；PA500μ mol/L组与其它任意组比较，TLR4的mRNA表达明显上调，且差异有统计学意义（P＜0.05）；综上说明在干预12小时终点时，TLR4的mRNA表达随着软脂酸浓度增高而增加，且在500μ mol/L浓度时其表达更是明显增加。细胞处理24小时结果：不同组之间细胞内TLR4的mRNA表达量总体有差别，差异有统计学意义（P＜0.05）；PA125μ mol/L组与d-BSA对照组相比、PA250μ mol/L组与PA125μ mol/L组相比、PA500μ mol/L组与PA250μ mol/L组相比表达均上调，且差异均有统计学意义（P＜0.05），说明在干预24小时终点时，TLR4的mRNA表达与软脂酸的浓度之间呈一定的浓度依赖关系。相同浓度组不同时间段比较：24小时较12小时表达有所增高，其中PA250μ mol/L组与PA500μ mol/L组均有统计学差异（P＜0.05）。 4.流式细胞仪检测结果不同浓度的软脂酸处理肾小管上皮细胞24h后，与对照组相比细胞膜TLR4蛋白水平明显增高，并随浓度增高而增加，且差异有统计学意义（P＜0.05），三组不同浓度软脂酸组之间两两比较，差异均有统计学意义(P0.05)。 5.ELISA方法检测结果细胞处理12h，24h终点时：d-BSA组与空白对照组上清液中可检测到微量IL-6、TNF-ɑ，两组相比，差异无统计学意义（p0.05）；12小时低浓度IL-6组与空白对照组比较，分泌有所增加，但差异无统计学意义（p0.05）；其余各软脂酸组干预组与空白对照组比较且各组两两比较，有的统计学差异(P0.05)，且IL-6、TNF-ɑ的分泌随PA浓度的增加明显增多；相同的处理浓度，干预24小时组较干预12小时组IL-6、TNF-ɑ的分泌明显增多，且差异有统计学意义(P0.05)。 主要结论 1.肾小管上皮细胞的生长、增殖受到软脂酸作用的影响。并且在12h及24h，0μ mol/L-500μ mol/L浓度范围内软脂酸的浓度与细胞的增殖呈负相关。 2.软脂酸可诱导肾小管上皮细胞TLR4mRNA的表达增高。 3.软脂酸诱导肾小管上皮细胞膜上TLR4蛋白的表达增高。 4.软脂酸可以促进肾小管上皮细胞IL-6及TNF-α的分泌，且IL-6、TNF-α分泌的高峰与TLR4mRNA及在细胞膜上蛋白表达的高峰基本接近，提示IL-6、TNF-α的增高可能与细胞膜上TLR4蛋白的表达有关，进一步推论，可能是软脂酸通过作用TLR4而间接促发炎症因子IL-6、TNF-α的表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R587.2;R692

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本文编号：2417955