多囊肾病中Cordon-bleu影响初级纤毛结构和功能的上下游机制研究

发布时间：2019-02-13 01:02

【摘要】：研究目的:常染色体显性多囊肾病是最常见的单基因遗传性肾病,由PKD1或PKD2基因突变引起编码的PC1和PC2表达异常所致,二种蛋白均表达于肾小管上皮细胞的初级纤毛。初级纤毛致病假说是目前最为关注的多囊肾病共同发病通路。前期课题组成功建立了多囊肾病PKD1基因敲入小鼠模型,通过蛋白组学的研究获得了多个囊肿相关差异表达蛋白,其中蛋白cordon bleu(Cobl)经过前期研究,发现在多囊肾病肾小管上皮细胞中表达异常,并引起初级纤毛的结构和功能变化。但Cobl如何被调控?Cobl又是通过哪个途径来影响初级纤毛,其机制尚未明确。本课题拟通过Western-blot、Realtime PCR、免疫荧光等实验方法,明确PC1/PC2的异常是否通过Ca2+/Ca M来调控Cobl表达;Cobl是否在SNX9作用下引起细胞骨架紊乱而导致初级纤毛异常。本课题的研究结果将丰富多囊肾病中初级纤毛的发病机制,为寻找干预靶标奠定一定的理论基础。实验方法:1.Ca M调控Cobl的机制研究:(1)通过免疫荧光、免疫组化方法观察多囊肾细胞及小鼠肾脏组织中Ca M的定位变化情况。(2)应用Real-time PCR及Western blot方法检测正常人肾小管上皮细胞(RCTEC)与不表达PC1的人多囊肾囊肿衬里上皮细胞(WT9-12),以及正常对照小鼠(pkd1+/+)与多囊肾病动物模型pkd1条件敲除小鼠(pkd1-/-)肾脏组织中Ca M的表达。(3)应用Western blot方法检测RCTEC中经si RNA干扰PC2表达对PC2、Ca M以及KIF3A的表达影响。(4)利用免疫共沉淀及免疫荧光方法检测Ca M与Cobl之间存在的相互结合作用,以及应用免疫荧光的方法验证RCTEC中Ca M与Cobl之间的定位。(5)应用Western blot方法检测经W7抑制RCTEC中Ca M表达后对Ca M、Cobl、KIF3A、IFT88的表达变化。(6)利用激光共聚焦显微镜观察W7抑制Ca M的RCTEC中初级纤毛形态结构变化。(7)应用Western blot检测经Ca Cl2刺激RCTEC后Ca M、Cobl、KIF3A的表达变化。(8)利用激光共聚焦显微镜观察经Ca Cl2刺激RCTEC后初级纤毛形态结构变化。2.SNX9在Cobl影响初级纤毛结构和功能的作用研究:(1)通过免疫荧光、免疫组化方法观察多囊肾细胞及小鼠肾脏组织中SNX9的定位变化。(2)应用Real-time PCR及Western blot方法检测正常人肾小管上皮细胞(RCTEC)与人多囊肾囊肿衬里上皮细胞(WT9-12),以及正常对照小鼠(pkd1+/+)与多囊肾病动物模型pkd1条件敲除小鼠(pkd1-/-)肾脏组织中SNX9的表达。(3)应用Western blot方法检测RCTEC中转染Cobl质粒过表达和经si RNA干扰Cobl后对Cobl、SNX9、KIF3A和IFT88的表达变化。(4)应用Real-time PCR检测SNX9基因过表达慢病毒的滴度,应用Real-time PCR及Western blot方法进行病毒液目的基因表达检测。(5)通过Western blot方法检测RCTEC中SNX9基因慢病毒过表达对SNX9以及纤毛功能指标KIF3A和IFT88的表达变化。(6)应用Western blot检测RCTEC中经si RNA-SNX9干扰下调后SNX9和IFT88的表达。(7)利用激光共聚焦显微镜观察SNX9基因慢病毒过表达SNX9及si RNA感染下调SNX9的RCTEC中F-actin、初级纤毛形态结构的变化。结果:1.Ca M调控Cobl的机制研究:(1)通过免疫荧光方法观察发现Ca M主要定位于胞浆与核膜;免疫组化方法观察发现pkd1+/+与pkd1-/-肾脏组织中Ca M主要位于肾小管中。(2)应用Real-time PCR及Western blot方法检测发现RCTEC中Ca M表达较WT9-12明显增多;pkd1条件敲除小鼠(pkd1-/-)肾脏组织中也得到相同结果。(3)应用Western blot方法检测发现RCTEC经si RNA干扰下调PC2表达后中PC2、Ca M、KIF3A表达均减少。(4)应用免疫共沉淀方法检测发现Ca M与Cobl存在相互作用;同时,通过免疫荧光方法发现RCTEC中Ca M与Cobl之间存在共定位。(5)应用Western blot及Real-time PCR方法检测发现经W7抑制RCTEC中Ca M表达后,Ca M、Cobl、KIF3A和IFT88的表达均下降。(6)利用激光共聚焦显微镜观察RCTEC中W7抑制Ca M后初级纤毛长度变短。(7)应用Western blot及Real-time PCR方法检测发现经Ca Cl2刺激RCTEC后Ca M、Cobl、KIF3A的表达均增加。(8)利用激光共聚焦显微镜观察经Ca Cl2刺激RCTEC后初级纤毛长度变长。2.SNX9在Cobl影响初级纤毛结构和功能的作用研究:(1)应用免疫荧光、免疫组化方法观察发现SNX9位于胞浆和细胞核,且主要位于肾小管。(2)应用Real-time PCR及Western blot方法检测发现RCTEC中SNX9表达较WT9-12中明显增多;多囊肾病动物模型pkd1条件敲除小鼠肾脏组织中也有相同的结果。(3)应用Western blot方法检测发现RCTEC中转染质粒过表达Cobl后,Cobl、SNX9、纤毛功能指标(KIF3A、IFT88)的表达均增加。(4)应用Western blot方法检测发现RCTEC中经si RNA-Cobl转染干扰Cobl表达后,Cobl、SNX9、KIF3A、IFT88的表达均减少。(5)SNX9基因过表达慢病毒大量包装及应用Real-time PCR进行滴度测定,包装所得慢病毒滴度至少为108 TU/ml;应用Real-time PCR及Western blot方法进行病毒液目的基因表达检测,发现SNX9过表达慢病毒有过表达效果,且在MOI-5时感染率已达到饱和。(6)应用Western blot方法检测发现RCTEC中SNX9基因慢病毒过表达SNX9后,SNX9、KIF3A和IFT88的表达均增加。(7)应用Western blot方法检测发现RCTEC中SNX9-si RNA下调SNX9表达后,SNX9、KIF3A、IFT88的表达均减少。(8)利用激光共聚焦显微镜观察发现RCTEC中SNX9基因慢病毒过表达SNX9,F-actin聚合增加,纤毛长度增加;而si RNA感染下调SNX9的RCTEC中F-actin含量减少,初级纤毛长度变短。结论:根据本研究的结果,表明当多囊肾基因PKD1、PKD2突变引起PC1、PC2表达异常后,Ca2+内流减少,Ca M表达降低,Cobl表达也随之减少。而Cobl异常通过SNX9影响F-actin的聚合作用,最终导致初级纤毛长度变短、细胞内钙离子浓度减少,进一步导致Ca M表达减少,产生恶性循环,加重多囊肾病的发生发展。而上调Cobl的上游Ca M或者下游SNX9表达能改善F-actin聚合作用,使初级纤毛长度增加。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692

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