【摘要】：研究背景:很久以来,精子被认为只是运送DNA进入卵细胞,而其他组分例如RNA分子只是残留物、不具有生理功能。近年来的研究进展表明,成熟精子中RNA分子可以通过受精方式传递给子代、参与调节受精卵和胚胎的发育。精子RNA可分为mRNA(message RNA,信使RNA)和ncRNA(non-coding RNA,非编码RNA)。迄今,通过microarray和RT-PCR等方法,众多的mRNAs和长度小于200个核苷酸的小ncRNAs已在人和其他哺乳动物精子中得到鉴定。然而,哺乳动物尤其是人的成熟精子是否存在长度大于200核苷酸的长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、及其可能的功能还远未阐明。lncRNA是近年来发现的一类具有表观遗传调控功能的重要生物大分子,与染色质调控蛋白、RNA结合蛋白、小RNA等相互作用形成功能复合体,调控多个重要生命过程。例如,已有研究表明睾丸特异性lncRNA对于雄性生殖至关重要、关键lncRNA的缺失会导致雄性不育,提示lncRNA分子异常可能与男性不育密切相关。男性不育已成为严重影响国民身心健康的重大疾病,其中以精子运动能力低下为主要特征的弱精症占相当大的比例,但相关的病因机制有待阐明。结合上述领域内研究热点以及临床需要,本研究拟回答:人成熟精子中是否存在lncRNA,它的表达谱是如何?如果人成熟精子内存在lncRNA,那么它是否与弱精症存在相关性呢,是否导致男性不育的重要因子?通过研究分析lncRNA在人成熟精子中的表达谱,验证并筛选出一些与弱精症有相关性的lncRNA,本课题期待为揭示弱精症的病因提供科学依据、为男性不育的发病机制提供新线索。研究方法:收集精子样本共84例,其中包括36例弱精患者的精子,随机12个捐助者的样本混匀后均分成三份;48例正常的精子样本,随机12个捐助者的样本混匀后均成四份。混合样品纯化后分离提取总RNA,并检测其纯度和质量,最后筛选7个混合样品,编号分别为:NS-1,NS-2,NS-3,NS-4,ATNZ-1,ATNZ-2,ATNZ-3。通过转录组测序,得到lncRNA在人成熟精子中的表达情况,并筛选出差异表达显著lncRNAs(Fold-change2.0,P0.01)。利用GO分析(Gene Ontology,基因本体论)和KEGG通路分析进一步研究。我们通过RT-PCR和荧光原位杂交(FISH)证实lncRNA转录物在人成熟精子中的存在。利用实时荧光定量PCR(QPCR)进行大样本量验证精子睾丸特异性且差异表达显著的lncRNAs。正常组和弱精症组lncRNAs表达水平的比较采用Mann-Whitney和双样本Kolmogorov-Smirnov两种非参数检验。分析差异表达lnc RNAs与弱精症的前向运动精子率(PR%)之间的相关性。同时构建出lncRNA与mRNA的共表达分析网络,分析预测这些差异表达的lncRNAs的功能和可能的致病机制。研究结果:1.在人成熟精子中鉴定了know lncRNA有38,307个和novel lncRNA有27,472个,并且通过RT-PCR和荧光原位杂交(FISH)在2个代表性的lncRNA上证实了lncRNA转录物的存在。2.正常精子(NS)组和弱精症(ATNZ)组中,共有2768个lncRNAs差异表达(Fold-change2.0,P0.01),其中2445个lncRNAs表达上调,323个lncRNAs表达下调;共有615个mRNAs差异表达,其中393个mRNAs表达上调,222个mRNAs表达下调。3.GO分析显示,将mRNA分成3类:生物学过程类(biological process)、细胞组分类(cellular component)、分子功能类(molecular function)。其中参与生物过程类基因显著富集(P0.01),包括:蛋白激酶C-激活,G蛋白偶联受体信号通路,肌动蛋白细胞骨架组织,RNA代谢过程的调节,基于肌动蛋白丝的过程和细胞连接组装。KEGG通路分析显示,差异表达的mRNA参与cGMP-PKG信号通路,NOD样受体信号通路,细胞凋亡等。4.NS组和ATNZ组中,预测出差异表达lncRNA的顺式调控(编码基因的上游10 kbp序列和lncRNA的下游100 kbp序列)和反式调控(自由能小于-30kj/mol)的靶基因。结果显示,找到lncRNA的靶基因mRNA有13131个。其GO富集分析表明,这些靶基因参与的生物过程包括:细胞器官组织,RNA转运,RNA代谢过程,参与形态发生的细胞成分装配,肌原纤维组装,肌动蛋白结构组织,肌动蛋白丝重组等过程。KEGG通路分析显示,差异表达的lncRNA靶基因参与包括蛋白质消化吸收,RNA转运,肌动蛋白细胞骨架调节,PI3K-Akt信号通路等途径。5.筛选得到睾丸精子特异性的lncRNA有48个。进行荧光定量PCR分别进行验证,最后得到只有5个精子睾丸特异表达的lncRNA,分别为:NONHSAG032058、NONHSAG009522、NONHSAG072018、LXLOC_098487、LXLOC_077183。临床大样本(51个正常样本和51个弱精样本)进行qRT-PCR实验证明,在睾丸精子特异性表达的LXLOC_098487,NONHSAG009522,NONHSAG072018,NONHSAG032058在弱精症患者中同时增加,与测序结果相同,表明它们可能共同涉及在调节成熟精子功能。6.结合上述结果5,LXLOC_098487在弱精症组和正常组中的表达水平存在显著性差异(非参数检验Mann-Whitney,P=0.011;非参数检验Kolmogorov-Smirnov,P=0.033);NONHSAG009522在弱精症组和正常组中的表达水平存在显著性差异(非参数检验Mann-Whitney,P0.001;非参数检验Kolmogorov-Smirnov,P0.001);NONHSAG072018在弱精症组和正常组中的表达水平存在显著性差异(非参数检验Mann-Whitney,P0.001;非参数检验Kolmogorov-Smirnov,P0.001);NONHSAG032058在弱精症组和正常组中的表达水平存在显著性差异(非参数检验Mann-Whitney,P=0.030;非参数检验Kolmogorov-Smirnov,P=0.037);分析临床精子样本中4条lncRNAs和精液基本参数的相关性,发现4个lncRNAs的表达水平和前向运动精子率(Progressive motility,PR,%)无相关性。7.组织特异性且差异表达lncRNA:NONHSAG072018,其靶基因为:NM_001145204(Shisa9)与通道蛋白有关,可能多层次参与调控通道蛋白的靶基因,并在其中扮演重要的角色。组织特异性且差异表达NONHSAG009522,NM_015423(AASDHPPT)参与氨基酸合成,泛酸代谢,线粒体代谢等。结论:1.本研究证实人成熟精子中存在lncRNAs,以及构建人成熟精子lncRNAs表达谱。该结果丰富人成熟精子中的RNA类型,为精子RNA功能的深入研究以及对男性不育等相关领域产生促进作用。2.以上结果显示,本研究初步筛选,并鉴定得到5个精子睾丸特异性且差异表达lncRNAs,与正常组相比,其中有4个lncRNAs在弱精中表达水平均呈上调趋势,符合测序结果。目前验证的5条候选lncRNAs初步证明与弱精症PR值无相关性,但是差异分析显示,弱精人群和正常人群之间是存在显著差异,表明lncRNA可能是弱精症的一个贡献因素。由于涉及的样本量相对较小,因此得出的结果需要可靠的,丰富的临床大样本及找到更正确的实验和统计分析进一步来进行验证。对5条候选lncRNAs进行RNA-PLEX软件预测出相对应的靶基因,最终其中只有两条找出靶基因,并进行GO分析和KEGG分析显示,可能多层次参与调控通道蛋白的靶基因,参与氨基酸合成,泛酸代谢,线粒体代谢等,并在其中扮演重要的角色。该结果为阐释弱精症的分子机制提供了实验基础,对精子发生和精子功能调节的研究具有重要的理论意义。因此,它们很有可能成为“弱精症相关分子标志群”中的新一员以发挥其临床价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R698.2
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