血管紧张素Ⅱ和12-脂氧化酶的相互作用对2型糖尿病肾病蛋白尿影响的机制研究

发布时间：2019-03-22 14:22

【摘要】：背景：糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，已经成为发达国家导致终末期肾脏病（end-stage renal disease，ESRD）的主要原因。蛋白尿和肾小球肥大是DN最重要的两个特征。多种机制包括肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的激活参与了DN蛋白尿的形成。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是RAS中最重要的效应分子，研究显示大部分已知的AngⅡ效应是由AngⅡ1型（AngⅡ type1，AT1）受体介导的。大量的临床和动物实验表明，AT1受体拮抗剂（AT1receptor blocker，ARB）可减轻DN肾损伤、降低尿蛋白水平，但其作用机制目前还不是十分清楚。脂氧化酶（lipoxygenase，LO）是一类多元不饱和脂肪酸的氧化酶。根据其氧化花生四烯酸时氧原子的插入位置不同，可分为5-、8-、12-和15-LO。12-LO以花生四烯酸为基质生成12（S）-氢氧化二十碳四烯酸[12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid，12(S)-HETE]。目前已证实12-LO及其作用产物12(S)-HETE主要通过氧化应激和炎症反应参与DN的发生和发展。研究发现用AngⅡ刺激肾小球细胞可激活12-LO活性，且ARB能降低肥胖Zucker大鼠肾组织内12-LO活性并延缓蛋白尿进展，然而DN时通过抑制AngⅡ-12-LO作用途径延缓蛋白尿的机制尚不完全清楚。足细胞构成肾小球滤过的第三道屏障，研究显示足细胞数目减少及裂孔蛋白功能缺陷是DN蛋白尿形成的重要原因。AngⅡ促进蛋白尿形成的机制与足细胞的上皮-间充质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和裂孔蛋白nephrin和P-cadherin表达减少有关。研究证实12-LO代谢产物12(S)-HETE亦能减少肾小球内P-cadherin表达。因此，本研究设想DN时用ARB阻断AngⅡ作用，可抑制12-LO活性，进而影响足细胞的EMT过程并上调nephrin和P-cadherin蛋白表达，减轻蛋白尿。胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病的重要特征，可通过多种机制参与DN蛋白尿的形成。研究显示12-LO参与2型DN时白蛋白尿的形成，而与1型DN时白蛋白尿的发生、发展关系不大。众所周知，1型和2型糖尿病的重要区别是IR，因此，我们设想12-LO可能通过影响IR作用于蛋白尿的发生和发展。方法： 1.用10-7mol/L AngⅡ处理足细胞24h，收集细胞上清液检测12(S)-HETE水平。 2.采用皮下包埋的微型渗透泵给大鼠持续恒速注入Ang Ⅱ（400ng Kg-1min-1），对照组大鼠泵注乙醇胺。14天后处死大鼠，提取肾小球，检测肾小球内12(S)-HETE水平及nephrin和P-cadherin蛋白表达。 3.采用皮下包埋的微型渗透泵给大鼠持续恒速注入12(S)-HETE（1mg Kg-1d-1），对照组大鼠泵注乙醇胺。7天后处死大鼠，提取肾小球，检测肾小球内AngⅡ水平及nephrin和P-cadherin蛋白表达。 4.采用高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素（streptozocin，STZ）注射的方法诱导2型糖尿病大鼠模型，模型成功后将大鼠随机分为2组：DN组和ARB组（洛沙坦灌胃，5mg Kg-1d-1）。以规律正常饮食大鼠作为对照组。6周后处死大鼠，收集24h尿液，提取肾脏，，分离肾小球。过碘酸-希夫氏（periodic acid schiff，PAS）染色观察肾组织结构，并检测肾小球内12(S)-HETE含量，nephrin、P-cadherin、足细胞上皮型标志蛋白及间充质标志蛋白表达。 5.野生型和12-LO基因敲除鼠，分为四组：野生型对照组（WT），12-LO基因敲除组（LOKO），野生型糖尿病组（WT+STZ）和12-LO基因敲除糖尿病组（LOKO+STZ）。采用一次性腹腔注射大剂量STZ法诱导1型糖尿病模型。实验期间连续监测小鼠血糖，并于实验结束前留取24h尿测尿白蛋白。 6.采用高脂饮食结合小剂量STZ诱导2型糖尿病模型，大鼠模型成功后随机分为2组：DN组和CDC（cinnamyl-3,4-dihydroxy-α-cynanocinnamate，12-LO抑制剂）组（CDC后腿皮下注射，8mg Kg-1d-1，3次/周）。以规律正常饮食大鼠作为对照组。8周后处死大鼠，收集24h尿液及血液，并检测空腹胰岛素水平。采用系列过筛法分离肾小球，并根据筛网孔径将肾小球分为大肾小球（125μm）和小肾小球（75μm）。ELISA检测AngⅡ、12(S)-HETE及尿白蛋白水平，放射免疫法检测空腹胰岛素水平，Western blot、RT-PCR检测相关蛋白表达，PAS染色观察肾组织结构。结果： 1. AngⅡ直接刺激诱导足细胞及大鼠肾小球内12(S)-HETE含量增加（P0.01）。用微型渗透泵给大鼠皮下注射12(S)-HETE后，大鼠肾小球内AngⅡ水平明显升高（P0.01）。 2. AngⅡ和12(S)-HETE刺激明显减少大鼠大肾小球内nephrin蛋白表达（P0.05），增加大鼠小肾小球内nephrin蛋白表达（P0.05）。皮下注射AngⅡ和12(S)-HETE后，大鼠大、小肾小球内P-cadherin蛋白表达均减少（P0.05）。 3．与对照组相比，DN组大鼠血糖、肾重/体重及24h尿白蛋白明显增加（P0.01），同时伴有肾小球肥大和细胞外基质积聚，洛沙坦对糖尿病大鼠血糖无明显影响，但明显降低肾重/体重及尿白蛋白水平（P0.05），减轻肾组织损伤。 4. DN组大鼠肾小球内12(S)-HETE水平较对照组明显升高（P0.01），洛沙坦治疗减少糖尿病大鼠肾小球内12(S)-HETE含量（P0.05）。 5.与对照组相比，DN组大鼠大肾小球内nephrin蛋白表达减少（P0.01），小肾小球内nephrin蛋白表达增加（P0.01），P-cadherin蛋白在大、小肾小球内表达均减少（P0.01）。洛沙坦增加糖尿病大鼠大肾小球内nephrin及大小肾小球内P-cadherin蛋白表达（P0.05）。 6.与对照组相比，DN组大鼠肾小球内足细胞形态标志蛋白紧密连接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）和podocin表达减少（P0.05），而间充质标志蛋白collagenⅠ、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、成纤维细胞特异性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，FSP-1）和desmin表达增加（P0.05）。洛沙坦治疗后，糖尿病大鼠肾小球内足细胞形态标志蛋白表达增加（P0.05），而间充质标志蛋白表达减少（P0.05）。 7. LOKO+STZ组小鼠尿白蛋白水平较WT组和LOKO组明显升高（P0.01），但与WT+STZ组相比无统计学差异。2型DN组大鼠尿白蛋白水平较对照组明显增加（P0.01），CDC治疗明显降低2型糖尿病大鼠的尿白蛋白水平（P0.05）。 8.1型糖尿病模型成功后一个月内，LOKO+STZ组小鼠血糖水平低于WT+STZ组；2型糖尿病模型成功后再给予CDC治疗，CDC对血糖水平影响不明显。 9.与对照组相比，2型DN组大鼠空腹胰岛素水平明显升高（P0.01），胰岛素敏感指数明显下降（P0.01），CDC治疗后，糖尿病大鼠空腹胰岛素水平明显下降（P0.05），胰岛素敏感指数明显升高（P0.05）。结论： 1.2型DN时AngⅡ和12-LO在肾小球内的相互作用可促进足细胞EMT，减少裂孔蛋白nephrin和P-cadherin表达。 2. ARB可阻断AngⅡ和12-LO在肾小球内的相互作用，进而阻止足细胞的EMT、增加裂孔蛋白nephrin和P-cadherin表达，延缓蛋白尿进展。 3.12-LO可通过IR参与2型DN蛋白尿的发生与发展。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】