甲烷饱和盐水对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2019-03-29 17:25

【摘要】：【目的】本课题观察甲烷饱和盐水对于小鼠肾缺血再灌注损伤是否存在保护作用。并初步探讨其是否通过降低氧化应激、降低巨噬细胞向肾组织的趋化、抑制巨噬细胞分泌细胞因子、降低炎症反应以及抑制肾小管上皮细胞凋亡来发挥其保护作用。【方法】1.48只小鼠采用随机数字表法随机分为六组:假手术组(Sham组)、甲烷饱和盐水组(MS组)、肾缺血再灌注组(RIR组)、肾缺血再灌注甲烷饱和盐水10ml/kg组(RIR+MS 10组)、肾缺血再灌注甲烷饱和盐水20ml/kg组(RIR+MS 20组)、肾缺血再灌注甲烷饱和盐水40mg/kg组(RIR+MS 40组),每组8只。其中RIR组和RIR+MS各剂量组小鼠采用双侧肾蒂夹闭45min的方法建立肾缺血再灌注模型。Sham组和MS组仅剖腹,不做其它操作。RIR+MS 10组、RIR+MS 20组、RIR+MS 40组和MS组在关腹后即刻分别经腹腔注射甲烷饱和盐水10ml/kg、20ml/kg、40ml/kg和20ml/kg。Sham组和RIR组在同样时间分别腹腔注射生理盐水20ml/kg。再灌注(或关腹后)24h取材,检测血清肌酐和尿素氮水平,同时取肾脏行病理学检查。2.24只小鼠采用随机数字表法随机分为四组:Sham组、MS组、RIR组和RIR+MS组,每组6只。每组处理方法同前,选择20 ml/kg作为本部分实验的给药剂量。再灌注后24h取肾组织检测MDA浓度及SOD、CAT和MPO活性水平。3.32只小鼠采用随机数字表法随机分为四组:Sham组、MS组、RIR组和RIR+MS组,每组8只。每组处理方法同前,选择20 ml/kg作为本部分实验的给药剂量。再灌注后24h取肾组织测定MCP-1 mRNA的表达水平。同时取肾脏制备单细胞悬液,流式细胞术检测巨噬细胞数量。ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10浓度。4.在体实验中,24只小鼠采用随机数字表法随机分为四组:Sham组、MS组、RIR组和RIR+MS组,每组6只。每组处理方法同前,选择20 ml/kg作为本部分实验的给药剂量。再灌注后24h取肾脏进行TUNEL染色。离体实验中,将HK-2细胞也分为4组:对照组(Sham组)、甲烷饱和盐水组(MS组)、缺氧复氧模型组(HR组)和缺氧复氧模型甲烷饱和盐水组(HR+MS组)。复氧24h后收集细胞使用Western blot法检测caspase 3蛋白表达水平。【结果】1.再灌注后24h,与Sham组比较,MS组、RIR+MS 20组及RIR+MS 40组小鼠血肌酐水平均无明显变化(P均大于0.05),而RIR组和RIR+MS 10组小鼠血肌酐水平则显著升高(p值均小于0.01);与rir组比较,rir+ms10组、rir+ms20组及rir+ms40组小鼠血肌酐水平均明显降低(p均小于0.01)。再灌注24h,与sham组比较,ms组小鼠血清尿素氮水平无明显变化(p0.05),rir组、rir+ms10组、rir+ms20组及rir+ms40组小鼠血清尿素氮水平则显著升高(p均小于0.05);而与rir组比较,rir+ms10组、rir+ms20组及rir+ms40组小鼠血清尿素氮水平均显著降低(p均小于0.01)。肾脏he染色显示,sham组和ms组小鼠肾组织中肾小管上皮细胞排列整齐,刷状缘完整,基底膜完整,肾小管中无管型无管腔堵塞;rir组则可见肾小管上皮细胞片状和灶状坏死,从基底膜上脱落,肾小管中可见管型及管腔堵塞,病变严重部位可见肾小管基底膜破坏;与rir组比较,rir+ms各剂量组肾小管上皮细胞片状和灶状坏死减少,病变程度较减轻,肾小管中管型少见,肾小管基底膜完整性较好。与rir+ms10组比较,rir+ms20组和rir+ms40组改善程度更为显著。而rir+ms20组和rir+ms40组之间比较则差别不明显。2.再灌注后24h,与sham组比较,ms组小鼠肾组织中mda浓度、sod活性、cat活性及mpo活性水平均无明显变化;而rir组小鼠mda浓度显著升高,sod活性和cat活性显著降低,mpo活性显著升高(p均小于0.01);rir+ms组小鼠肾组织mda水平与mpo活性均升高(p均小于0.05),而sod活性和cat活性无明显变化(p均大于0.05)。与rir组比较,rir+ms组小鼠肾组织mda水平明显降低,sod活性和cat活性显著升高,mpo活性显著降低(p均小于0.01)。3.再灌注后24h时,与sham组比较,ms组小鼠肾组织中mcp-1的表达无明显变化(p0.05),rir组和rir+ms组小鼠肾组织中mcp-1表达则显著升高(p值均小于0.01);与rir组比较,rir+ms组小鼠肾组织中mcp-1表达显著降低(p0.01)。而巨噬细胞计数结果显示,与sham组比较,ms组和rir+ms组小鼠肾组织中巨噬细胞数量均无明显变化(p均大于0.05),rir组小鼠肾组织中巨噬细胞数量则显著升高(p0.01);与rir组比较,rir+ms组小鼠肾组织中巨噬细胞数量明显降低(p0.01)。血清炎症因子检测结果显示,与sham组比较,ms组小鼠血清tnf-α和il-6无显著变化,il-10水平升高(p0.01),rir组和rir+ms组小鼠血清tnf-α、il-6和il-10水平则显著升高(p均小于0.01);与rir组比较,rir+ms组小鼠血清tnf-α和il-6水平明显降低,il-10水平显著升高(p均小于0.05)。而各组间il-1β水平无明显变化(p0.05)。4.再灌注后24h,与sham组小鼠比较,rir组小鼠肾脏tunel染色显示肾组织中凋亡细胞显著增多,而rir+ms组小鼠肾脏凋亡细胞数量较rir组显著减少。而hk-2体外实验显示建立体外缺氧复氧模型后,caspase3表达显著上调;而给予甲烷饱和盐水处理后,caspase 3表达与HR组比较显著下调。【结论】在关腹后即刻腹腔注射MS可显著减轻小鼠肾缺血再灌注损伤。其保护作用可能与其抗氧化应激、抑制巨噬细胞向缺血再灌注后的肾脏趋化、减轻机体炎症反应以及减少肾小管上皮细胞凋亡有关。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692.5

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