大电导钙激活钾（BK）通道在大鼠膀胱ICC细胞兴奋性调控中的作用初探

发布时间：2019-08-17 14:21

【摘要】：目的：膀胱兴奋性异常是最常见的膀胱功能障碍之一，神经病变、部分膀胱出口梗阻(PBOO)、炎症和其它因素最终会导致膀胱的兴奋性变化，临床上可引起尿频、尿急、尿失禁、懒膀胱等症状，甚至还将导致肾或输尿管积水以及肾脏的功能损害[1]。逼尿肌不稳定(DI)为膀胱在储尿期发生的自发非排尿性的收缩，是常见的膀胱兴奋性异常。目前，导致膀胱兴奋性异常的病因还没有被完全阐明，对DI的发病机制也还存在较大争议，“神经源性学说”和“肌源性学说”都能一定程度解释膀胱兴奋性异常的机制，前者认为膀胱兴奋性由中枢和外周神经系统控制，而后者认为膀胱逼尿肌兴奋性的改变能够主动参与膀胱功能的调节。临床上针对兴奋性异常的治疗主要采取神经受体活性药物，但治疗效果并不明显，因此，肌源性因素日益受到重视。目前越来越多的证据证明膀胱存在着类似在胃、肠道中的起搏样卡哈尔间质细胞(ICCs)，犹如在胃肠道中的功用，膀胱ICC细胞很可能也具有起搏功能，并通过细胞间连接将信号向平滑肌传播，，对膀胱的兴奋性起源和调节以及信号的传递发挥重要的枢纽功能。 ICC细胞上各种离子通道对细胞功能的发挥具有重要作用，目前在ICC细胞上发现的通道有超极化激活的环核苷酸门控阳离子(HCN)通道、T型钙通道、钠钙交换体、ATP依赖的钾通道等，大电导钙激活钾(BK)通道在膀胱ICC细胞中的作用还没有得到充分的认识。BK通道由细胞膜去极化或钙离子内流激活，通过使动作电位复极化，反馈性的抑制细胞的兴奋，然而BK通道是否在ICC细胞发挥调节功能还缺乏深入的探索，研究膀胱ICC细胞上BK通道可为膀胱兴奋性异常的基础研究提供新的方向。本课题通过分子生物和细胞形态学等技术方法对BK通道以及亚型在膀胱ICC细胞中的表达及分布进行了观察，对膀胱ICC细胞上BK通道的电活动生理特性进行了初步观测，并利用功能学方法对BK通道参与ICC细胞兴奋性调控的机制进行了初步研究。构建方法： 1.采用2-3月龄大鼠为研究对象，对模型组实施PBOO手术导致DI，与正常大鼠进行对比研究。 2. Western blotting检测大鼠膀胱BK通道亚型的表达。 3.免疫荧光双染实验观测BK通道亚型在膀胱ICC细胞中的分布，对比DI与正常膀胱ICC细胞BK通道表达变化。 4.利用全细胞膜片钳技术对急性分离的正常及DI大鼠膀胱ICC细胞上的BK通道外向电流进行观测，并记录阻断剂IBTX加入后电流的改变以及区别。 5.单细胞RT-PCR技术对膜片钳电极钳取的ICC细胞进行鉴定。 6.激光共聚焦显微镜记录培养的正常及DI大鼠膀胱ICC细胞胞内的钙离子浓度在BK通道阻断剂作用下的变化，比较两组间变换的区别，以此了解BK通道在ICC细胞兴奋性中的功用。结果： 1.大部分行部分膀胱出口梗阻手术后的大鼠表现出DI症状，可用作研究模型。 2. WB检测到大鼠膀胱中BK通道蛋白表达，免疫荧光染色观测到正常及DI大鼠膀胱组织片c-kit阳性的细胞同时表达BK免疫反应阳性。并且通过荧光像素值进行比较分析发现DI膀胱ICC细胞中BK通道表达较少。 3.成功获得急性分离大鼠膀胱ICC细胞，记录到典型的BK外向电流，BK通道阻断剂IBTX作用后能显著降低该电流强度，通过对比发现DI大鼠膀胱ICC细胞BK电流强度低于正常。 4. IBTX能使静息状态下膀胱ICC细胞胞内钙离子浓度升高。然而DI大鼠膀胱ICC细胞胞内钙离子浓度升高的幅度小于正常。 5.成功对检测细胞进行了单细胞RT-PCR，证明记录数据的细胞表达C-KIT而不表达Myosin。结论：大鼠膀胱ICC细胞存在BK通道，亚型以α、β1、β2、β3、β4为主。 BK通道参与了使动作电位复极化并稳定膀胱ICC细胞膜电位的作用。抑制BK通道会增高胞内的钙离子浓度，BK通道功能与膀胱上ICC细胞的兴奋性紧密相关。 BK通道对膀胱ICC细胞的调节作用与DI的发生密切相关。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R694.5

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