【摘要】：研究目的与意义急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)已成为全球性的公共健康问题,其死亡率居高不下且极易发展为慢性肾病及终末期肾病。其常见的诱因包括:肾缺血再灌注、肾毒性药物、脓毒症等。急性肾损伤的病理生理学机制十分复杂,免疫炎症反应在急性肾损伤中发挥了非常关键的作用。急性肾损伤后肾小管上皮细胞发生变性、坏死,释放损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DMAP),后者被模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)识别进而激活固有免疫反应。同时,肾小管上皮细胞也表现出免疫细胞的活性,一方面产生炎性介质,另一方面表达模式识别受体和主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子等。肾小管周围的微血管内皮细胞通透性增加,表达粘附分子,促进炎症细胞的粘附和迁移。此外,各种免疫炎症细胞在损伤区域浸润,进一步活化释放大量炎性介质,导致炎症反应放大以及肾小管上皮细胞进一步损伤。肾组织内这三大类效应细胞相互影响,共同参与了肾脏局部固有免疫及适应性免疫功能紊乱,导致肾脏持续处于过度炎性状态,是引起急性肾损伤的主要机制。近年来,连接黏附样分子蛋白(junctional adhesion molecule-like protein,JAML,amical)在免疫细胞活化和炎症反应中的作用日益受到重视。JAML作为新型的连接黏附分子,是一种分泌性的Ⅰ型跨膜糖蛋白。其结构特点使它不仅可以介导细胞间相互作用,而且可以与细胞内蛋白结合从而介导下游信号通路。然而,JAML在急性肾损伤中是否扮演着重要角色,迄今仍未见报道。所以,探讨JAML在急性肾损伤中的作用有非常重要的意义。本课题将探讨JAML如何参与肾脏区域免疫调节,为阐明肾脏的免疫学机制,寻找新的免疫治疗靶点提供理论依据。研究方法1.JAML在肾缺血再灌注小鼠模型中的表达变化1.1体内模型的建立及JAML的检测用雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6小鼠构建急性肾缺血再灌注模型,用蛋白质免疫印迹法(westernblot,WB)、实时荧光定量反转录聚合酶链反应法(Real-time RT-PCR)以及免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测JAML在肾缺血再灌注各组织中的表达变化;另外腹腔注射顺铂构建急性肾损伤模型,并用IHC检测JAML的表达变化。1.2 JAML与肾小管不同部位标记物共定位用组织免疫荧光法(immunofluoresce,IF)对JAML与肾小管标记物蛋白进行荧光共定位。1.3体外模型的建立及JAML的检测培养人近曲小管上皮细胞(HK-2),体外模拟肾缺血再灌注模型:糖氧剥夺法(oxygen glucose deprivation,OGD);给药抗霉素A/2-脱氧葡萄糖(AA-2DG);给药氯化钴(CoCl2)。WB检测这几种条件下HK-2细胞中JAML蛋白水平变化。另外,通过缺氧处理的HK-2细胞复氧后,用其上清处理巨噬细胞,WB检测巨噬细胞中JAML的蛋白水平变化。2.JAML在小鼠肾缺血再灌注损伤中的作用2.1野生型与JAML-/-小鼠肾脏功能学指标的对比高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)检测野生型与JAML-/-(JAML knockout)小鼠血清中肌酐含量。罗氏Cobas 8000全自动生化分析仪分析野生型与JAML-/-小鼠血清中尿素氮的含量。2.2野生型与JAML-/-鼠肾脏形态学损伤的对比苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)对野生型与JAML-/-小鼠的肾脏石蜡切片进行染色,并进行形态学损伤评分。原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling,TUNEL)检测野生型和JAML-/-小鼠肾脏细胞凋亡情况。2.3小鼠肾缺血再灌注模型炎症指标检测Real-time RT-PCR检测野生型与JAML-/-小鼠肾脏炎症因子的含量。IHC检测野生型和JAML-/-小鼠肾脏切片巨噬细胞标记蛋白CD68、中性粒细胞标记蛋白Ly6B。3.在肾缺血再灌注损伤中JAML对下游分子Clec4e的影响通过基因芯片技术分析肾缺血再灌注野生型和JAML-/-小鼠间的差异表达基因,并绘制模式识别受体家族分子热图。Real-time RT-PCR对筛选出来的基因做进一步验证。RT-PCR检测巨噬细胞与HK-2细胞中模式识别受体Clec4e的表达变化。进而,用AA/2-DG刺激HK-2细胞观察Clec4e的变化。研究结果1.JAML在肾缺血再灌注模型中的表达变化1.1小鼠肾缺血再灌注模型中JAML的表达水平显著上升RT-PCR和WB证明JAML在成年小鼠灌流干净的肾脏、脾脏、心脏、小肠、肺中均有表达;Real-time RT-PCR及WB检测小鼠肾脏中JAML表达。结果显示,JAML的mRNA水平与蛋白水平与假手术组相比显著上升,这一结果在IHC中也得到验证。1.2 JAML主要表达在肾近曲小管中IF检测发现,JAML主要表达在近曲小管中,外髓质远曲小管也有表达,髓质集合管中的表达较弱。1.3体外模型条件下JAML的蛋白水平显著升高采用三种方法OGD、AA-2DG、CoCl2处理HK-2细胞,JAML的蛋白水平均显著升高。用缺氧处理的HK-2上清液培养巨噬细胞后,巨噬细胞中JAML蛋白水平同样升高。2.JAML在肾缺血再灌注损伤中具有促进损伤的作用缺血再灌注后,JAML-/-小鼠血清中肌酐和尿素氮低于野生型小鼠,肾脏损伤减轻,肾脏中浸润巨噬细胞和中性粒细胞数量减少,炎症因子表达下降,凋亡细胞减少。说明JAML的缺失减轻了肾缺血再灌注损伤。3.JAML调控Clec4e参与的体外缺血再灌注肾损伤通过基因芯片技术发现Clec4e和其家族个别成员在缺血再灌注损伤后表达明显上调,JAML缺失可明显恢复损伤所诱导的这些基因的表达。Real-time RT PCR证实了这一结果。RT-PCR检测发现,与巨噬细胞相比,Clec4e在HK-2细胞中基础表达量低,AA/2-DG刺激后诱导其表达升高,说明Clec4e参与了缺氧缺糖诱导的HK-2细胞损伤。结论与创新性1.首次对JAML在急性肾损伤中的表达变化进行表征:肾缺血再灌注损伤小鼠肾脏中JAML的表达显著升高,且这一结果也在顺铂诱导的急性肾损伤模型中得到证实。2.首次证明JAML促进了肾缺血再灌注损伤的发生发展。因此,下调JAML的表达可抑制肾缺血再灌注损伤的发生发展和减轻炎症反应。3.初步探讨了 JAML促进肾缺血再灌注损伤发生发展的机制,证明其对下游模式识别受体Clec4e的正调控作用。综上所述,本课题有助于进一步阐明JAML诱导急性肾损伤的病理生理学机制,一方面为防治急性肾损伤提供潜在药物靶点,另一方面,JAML将有可能作为急性肾损伤发生和发展检测的重要指标。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692
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本文编号：2531684
