IgA肾病尿沉渣特异性miRNAs筛选与验证及其细胞来源分析

发布时间：2019-10-02 00:27

【摘要】：背景和目的：IgA肾病（IgAnephrophathy, IgAN）是我国最常见的慢性肾脏病，也是导致我国终末期肾脏疾病（尿毒症）的最主要病因。多数IgAN是进展性疾病，因此，临床上需要能及时反映IgAN病情变化的生物标志物用以诊断、评估病情、指导治疗和判断预后。尿沉渣miRNA是2010年以来寻找IgAN标志物新的方向，国内外也有学者开展了有益的尝试，发现某些miRNAs与IgAN的临床病理和预后有一定相关。但由于是单中心、小样本研究，对IgAN疾病特征反映并不全面。本课题第一次利用miRNA芯片结合生物信息学技术，高通量筛选IgAN新的miRNA分子标志物，进而通过荧光定量PCR验证，筛选出几种IgAN特异性的miRNA标志物，评估其对IgAN诊断及病情判断中的作用。进一步明确上述miRNAs标志物在尿沉渣中的具体细胞来源及其可能的作用，为IgAN无创诊断研究奠定基础。 方法：收集中国人民解放军总医院肾脏病科2012年11月至2014年1月首次经肾活检证实的IgAN患者。正常对照组为年龄性别匹配的健康人。疾病对照组为首次经肾活检证实的非IgAN原发性肾小球疾病患者。在肾活检前留取尿液标本，通过离心分离尿沉渣和尿液上清。肾脏病理采用Lee氏分级和半定量评分。1、尿沉渣miRNA芯片检测：提取尿沉渣总RNA，利用安捷伦公司miRNA芯片V19.0对9个IgAN患者（3个LEE氏II级，3个III级和3个IV-V级）和3个正常人进行差异miRNAs筛选。并与文献报道的IgAN肾组织和外周血白细胞的miRNAs芯片结果进行对比分析，明确三组不同样本来源miRNAs表达趋势的异同。2、尿沉渣miRNA标志物的验证与临床病理相关分析：利用SYBR Green荧光定量PCR，扩大样本人群，检测尿沉渣miRNAs在84个IgAN患者、29个正常人和21个疾病对照组患者中的表达差异。绘制ROC曲线（receiver operating characteristic curve，受试者作业特征曲线）评估几种标志物诊断IgAN的敏感度和特异度。并分析其与IgAN临床、病理指标的相关关系。3、利用磁珠分离尿红细胞和尿上清液微泡提取等技术，确定miRNAs标志物的具体细胞来源，并分析其可能的生物学作用。 结果：1.利用高通量miRNAs芯片结合生物信息学技术，筛选出IgAN组和正常对照组尿沉渣差异表达的miRNAs共214个。此外还发现有92个miRNAs在IgAN不同病理分级间（LEE氏II级，III级和IV-V级）有表达差异。通过与文献报道的IgAN肾组织和外周血白细胞的miRNAs芯片结果进行对比分析，发现三种样本来源miRNAs的表达趋势异同。尿沉渣与肾组织miRNAs芯片结果相比，有54.55%的miRNAs趋势一致，33.78%趋势相反。与外周血白细胞芯片结果对比，有48.65%的miRNAs趋势相同，2个miRNAs趋势相反。汇总三个芯片结果发现，miR-98，miR-148b，let-7d，miR-374b，miR-17和miR-502-3p在三个miRNA芯片结果中都有显著差异。 2. IgAN组的尿沉渣miR-25、miR-144、miR-486表达量显著高于正常对照组和疾病对照组，而IgAN组miR-135a和miR-150表达水平则显著低于正常对照组。尿沉渣miR-25、miR-144和miR-486是IgAN的特异性生物标志物，其联合诊断IgAN的特异性达100%，敏感性为89.9%。此外，IgAN组miR-144、miR-486和miR-150在不同Lee氏分级的亚组中，表达量有显著差异，miR-144和miR-486在Lee氏III级中表达量最高，而miR-150则在Lee氏IV-V级中表达水平最高。miR-150与全球硬化呈正相关。而miR-144、miR-135a、miR-150与节段硬化呈正相关。MiR-486与新月体呈负相关，而miR-135a则与新月体呈正相关。有肾血管病变组miR-486的表达量显著高于无血管病变组。间质纤维化轻度、中度、重度的3组间miR-150的表达量有显著差异，重度纤维化组表达量显著高于轻度组和中度组。此外，还发现miR-135a、miR-25和miR-486与包曼囊壁节段增厚和分层有密切关系。在临床指标中，miR-25、miR-144、miR-486、miR-150与Cys呈正相关。MiR-486、miR-150与Scr呈正相关，且miR-486与eGFR呈负相关。 3.本研究首先发现miR-25、miR-144和miR-486在尿红细胞满视野组的表达量显著高于非满视野组。利用磁珠分离尿红细胞技术将红细胞分离提纯（红细胞组）发现上述miRNAs表达量大大升高，而不含红细胞组上述miRNAs表达量则显著降低。正常人中上述miRNAs表达水平很低，在加入自身血红细胞后尿沉渣上述miRNAs表达显著增加。体外分离尿沉渣中含有的主要细胞成分，白细胞、红细胞、肾小管上皮细胞，检测miR-25、miR-144和miR-486的表达量，发现红细胞中miRNAs的基线水平也显著高于其他细胞。 4、IgAN组和正常对照组的血红细胞miR-144和miR-486的表达量无显著差异，而IgAN组miR-25的表达显著低于正常对照组。向IgAN患者尿上清液中加入患者自身血红细胞，制造外科性血尿模型，发现IgAN尿红细胞miR-25、miR-144和miR-486的表达量显著高于外科性血尿模型组。进一步实验还发现，IgAN组尿上清液微泡中miR-144和miR-486表达量显著高于正常对照组，且微泡中miR-486相对表达量很高。 5、本研究已经发现，miR-25和miR-486这两个红细胞来源的miRNAs与包曼囊壁节段增厚和分层密切相关，有节段增厚和分层组miR-25和miR-486的表达量显著升高。本研究纳入的IgAN患者中，有71.43%存在包曼囊壁节段增厚和分层，显著高于疾病对照组的9.52%。这与尿沉渣中IgAN组miR-25和miR-486表达量显著高于疾病对照组一致。IgAN尿红细胞满视野伴尿蛋白阳性者包曼囊弥漫性增厚组的肾小球比例为72.34%，高于尿红细胞非满视野伴尿蛋白阳性组的54.5%。 结论：本研究采用miRNA芯片结合生物信息学技术分析了IgAN尿沉渣miRNAs表达谱，并发现与来源于肾组织及外周血白细胞表达谱的异同。进而筛选出可用于无创诊断IgAN的miRNAs，不仅具有病疾病诊断特异性，而且与临床、病理指标有良好相关性。尿沉渣miR-25、miR-144和miR-486主要来源于尿中红细胞，与包曼囊壁增厚和分层密切相关。尿红细胞miRNA可能通过微泡释放，发挥生物学作用，参与IgAN的病理生理改变。其具体作用机制需要进一步研究。
【图文】：

16图 1-1. 正常对照组（左侧）与 IgAN 轻度组（右侧）间尿沉渣 miRNA 表达谱的差异（共发现 189 个差异表达的 miRNAs，列出的是 p＜0.01 的指标）。

17图 1-2. 正常对照组（左侧）与 IgAN 硬化组（右侧）间尿沉渣 miRNA 表达谱的差异（共发现 23 个差异表达的 miRNAs，列出的是 p＜0.01 的指标）。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692.31

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本文编号：2544658