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雷洛昔芬对镉诱导肾损伤致1-α羟化酶变化的干预

发布时间:2019-11-13 12:41
【摘要】:目的:本实验通过提取和体外培养SD大鼠的肾小管上皮细胞并建立氯化镉染毒的细胞模型,检测氯化镉染毒24h后以及雷洛昔芬干预氯化镉染毒24h后的SD大鼠肾小管上皮细胞的增殖情况,以及雷洛昔芬对氯化镉诱导下肾小管上皮细胞损伤致1-α羟化酶的变化的干预,为临床上干预镉中毒引起的骨质疏松开辟新思路。方法:选取10只新生(出生不足24h)SD大鼠,SD大鼠肾小管上皮细胞原代的提取以及分离纯化采用Percoll密度梯度离心法,用细胞形态学鉴定法对所提取的肾小管上皮细胞进行鉴定。对于原代的培养,培养液所含胎牛血清的浓度需高些(本研究所用浓度为15%);对于传代细胞的培养,本研究使用的的浓度为10%。本研究所包含的全部检测方法均选取第3代肾小管上皮细胞。细胞相对生存率的检测采用MTT法,应用不同剂量(2.5、5、10、20、40μmol/L)的氯化镉对肾小管上皮细胞进行染毒,处理时间为24h;应用不同剂量的雷洛昔芬(0.05、0.1、0.5、1μmol/L)以及固定剂量的氯化镉(20μmol/L)共同处理细胞,处理时间为24h。将肾小管上皮细胞分为:A组(对照组):应用不添加任何试剂的低糖培养基10ml处理细胞;B组(氯化镉组):应用含有20μmol/L氯化镉的低糖培养液10ml处理细胞;C组(雷洛昔芬组):应用含有20μmol/L氯化镉以及0.1μmol/L雷洛昔芬的低糖培养液10ml处理细胞,处理时间为24h。逆转录-聚合酶链反应:1.三组肾小管上皮细胞总RNA的提取:选取Trizol法;2.逆转录:选用天跟逆转录试剂盒逆转录成c DNA;3.目的片段的扩增:选用RT-PCR法;4.1-α羟化酶基因的表达水平的检测。选取SPSS18.0统计软件对本研究数据进行统计学分析,P0.05认为差异有统计学意义。结果:未贴壁SD大鼠肾小管上皮原代细胞为球状,培养2d后细胞完全贴壁,继续培养4~5d左右细胞可长满10cm皿底,培养的传代细胞呈多边鹅卵石铺路石状;本研究RT-PCR结果:A组肾小管上皮细胞与培养皿底贴合紧密,细胞形态正常;B组肾小管上皮细胞与培养皿底贴合不紧密,大部分细胞形态异常,大量细胞死亡;C组与B组的肾小管上皮细胞相比,细胞与培养皿底贴合较为紧密,较少数细胞发生形态改变。MTT实验显示:各镉染毒组细胞增值情况与对照组相比明显下降(P0.01),细胞增值情况与镉浓度呈反比,20μmol/L Cd Cl2作用24h即可使肾小管上皮细胞增值情况由100.00%下降至51.82%;各雷洛昔芬干预组肾小管上皮细胞增值情况与镉染毒组相比显著升高(P0.01),0.1μmol/L RAL干预24h后可使肾小管细胞的增值情况升高至168.85%。RT-PCR研究显示:B组1-α羟化酶基因的表达与A组相比显著下降(P㩳0.01);C组肾小管上皮细胞内1-α羟化酶基因的表达与B组相比明显增高(P0.05)。结论:氯化镉对肾小管上皮细胞具有毒性损伤作用,损伤作用随着剂量增高而增强,雷洛昔芬对于氯化镉染毒的肾小管上皮细胞具有干预作用,且不同剂量的雷洛昔芬干预效果不同。其机制可能是通过干预氯化镉诱导下肾小管上皮细胞损伤导致的1-α羟化酶基因的表达,进而调节体内钙磷代谢,从而干预重金属镉中毒导致的骨质疏松,为临床上应用RAL治疗重金属镉中毒导致的骨质疏松奠定基础。
【学位授予单位】:桂林医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R692

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本文编号:2560310

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