溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A体内外功能评价及治疗前列腺癌的实验研究

发布时间：2019-11-22 07:11

【摘要】：前列腺癌是西方国家最为常见的男性恶性肿瘤之一。近年来，随着人口老龄化和饮食结构的改变，我国前列腺癌的发病率逐年上升，严重威胁着老年人口的生活质量和预期寿命。前列腺癌的病程进展缓慢，早期采用前列腺切除术可显著提高治愈率；但当晚期发生转移时，一般采用放化疗、内分泌疗法等手段，但治愈率低，10年生存率不足10%，而且易导致其进展为激素非依赖型前列腺癌。总之，目前对于晚期、转移及激素非依赖型患者仍然缺乏有效手段，因此，亟需寻找一种新的治疗方案。基因治疗能有效针对肿瘤发生、发展的各个关键环节，已成为提升前列腺癌治疗水平的重要力量。目前，已有多项前列腺癌基因治疗药物处于临床试验阶段。溶瘤病毒和免疫基因治疗是基因治疗的两大重要方向。溶瘤腺病毒不但能够在肿瘤细胞中特异性复制并杀伤肿瘤细胞，而且还能介导治疗基因在的高效表达，进而发挥疗效；而免疫基因治疗，能够通过向肿瘤细胞或肿瘤微环境导入免疫基因或免疫调节基因，激活机体抗肿瘤免疫反应。有研究表明，CD40L与肿瘤抗原融合表达，可以通过CD40与CD40L的相互作用，将肿瘤抗原靶向树突状细胞（Dendritic Cell, DC），进一步激活T淋巴细胞和特异性抗肿瘤免疫反应。本课题组前期工作中，集合溶瘤腺病毒与免疫基因治疗的优势，构建了携带前列腺特异性抗原（Prostate SpecificAntigen，PSA）和CD40L融合蛋白基因（PSA-CD40L，PL）的前列腺癌特异性溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A，并进行了初步评价。本课题将在以往工作基础上，系统评价Ad-PL-PPT-E1A的体外溶瘤及免疫激活效应，，同时，探讨其体内抗肿瘤效应。首先，在已经制备携带PL基因的前列腺癌特异性溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A和非溶瘤对照病毒Ad-PL的基础上，采用本实验室建立的以Adeasy系统为基础的溶瘤腺病毒构建体系，构建和制备单纯溶瘤对照病毒Ad-PPT-E1A。采用逆转录聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法鉴定病毒基因组，采用蛋白印记（Western-blotting）检测目的基因（PL、E1A）的表达。鉴定正确后，大量扩增病毒，采用氯化铯（Caesium Chloride，CsCl）密度梯度离心纯化病毒，TCID50法测定其感染滴度为6×1011IU/ml。接着，在体外分别对Ad-PL-PPT-E1A的特异性复制和溶瘤效应进行评价：（1）5MOI溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A及阳性对照病毒Ad-TPE-CD80-GM感染前列腺癌细胞PC3、PC3M、DU145、LNCaP，以及对照细胞L02、HepG2、Hela后，分别于感染后24h、48h和72h收集细胞和上清，TCID50测定病毒活性，结果显示，前列腺癌细胞中病毒活性呈时间依赖性增加，而在非前列腺癌细胞中无明显改变，表明Ad-PL-PPT-E1A具有前列腺癌特异性的复制能力；（2）为进一步明确病毒复制的机制，我们在前列腺癌细胞中，采用Western-blotting和real-time PCR方法分别检测了Ad-PL-PPT-E1A介导的腺病毒复制必需基因E1A的表达，结果显示，E1A的表达在前列腺癌细胞中呈现剂量和时间依赖性的增加，与病毒活性检测结果一致；（3）病毒复制可造成细胞裂解和死亡，流式细胞检测结果显示，Ad-PL-PPT-E1A和单纯溶瘤对照病毒Ad-PPT-E1A能够有效杀伤前列腺癌细胞，并呈时间和剂量依赖性的增加，而对照病毒Ad-PL对前列腺癌细胞凋亡无明显影响；（4）同时，结晶紫检测结果显示，溶瘤腺病毒具有前列腺癌特异性杀伤效应：例如，感染后6d，0.1MOI Ad-PL-PPT-E1A对激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP的杀伤率可达99%；10MOI Ad-PL-PPT-E1A对激素非赖性前列腺癌细胞PC3M的杀伤率为70%左右，而10MOI的Ad-PL-PPT-E1A其对正常细胞及其他类型肿瘤细胞无明显的杀伤作用。接下来，我们对Ad-PL-PPT-E1A的体外免疫激活效应进行了评价。（1）溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A感染前列腺癌细胞后，real-time PCR检测结果显示，嵌合免疫基因PL表达呈现剂量和时间依赖性增加；（2）将感染Ad-PL-PPT-E1A的前列腺癌细胞裂解液，与Ficoll分离获得的人外周血单个核细胞共孵育后，能够恢复肿瘤细胞裂解液对单个核细胞增殖的抑制效应；（3）在体外，将人外周血单个核细胞诱导成DC，并用Ad-PL-PPT-E1A或者Ad-PL感染的前列腺癌细胞裂解液致敏，两天后，流式细胞检测结果显示，Ad-PL-PPT-E1A和Ad-PL均能上调DC表面分子CD80、CD83和CD86；real-time PCR检测结果显示，DC成熟相关细胞因子的表达增强。结果表明，溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A能够增强LNCaP细胞裂解液对DC成熟的促进作用。最后，我们检测了溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A的体内抗肿瘤效应。首先，采用皮下荷瘤方式成功建立了人前列腺癌细胞PC3M的裸鼠移植瘤模型，分次瘤内给药进行治疗（2×108IU/100μl/次，连续给药5天），观察肿瘤生长状态和生长曲线，结果显示，与Ad-Null组相比，Ad-PL-PPT-E1A和Ad-PPT-E1A能够明显提高小鼠的存活率和抑制肿瘤的生长，其中，Ad-PL-PPT-E1A表现出更强的抗肿瘤效应；同时，real-time PCR检测结果显示，Ad-PL-PPT-E1A可高效介导目的基因PL和E1A在移植瘤中的表达。综上所述，Ad-PL-PPT-E1A能够在体外发挥前列腺癌特异性复制和溶瘤作用；同时，Ad-PL-PPT-E1A能够在体外增强前列腺癌细胞的免疫激活作用。此外，Ad-PL-PPT-E1A能够抑制前列腺癌细胞PC3M移植瘤的生长。上述结果表明，Ad-PL-PPT-E1A结合了溶瘤腺病毒和免疫基因治疗的优势，有望成为前列腺癌治疗的基因治疗候选药物。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

【参考文献】