多个基因参与microRNA-107在透明细胞肾癌中发挥抑制作用

发布时间：2019-11-22 10:30

【摘要】：目的：肾癌对放化疗不敏感,对于肾癌的治疗目前仍以手术治疗为主,由于早期缺乏敏感及特异的检测指标,30%的患者发现肿瘤已经有了转移。因此亟待寻求一种新的基因位点作为肾癌早期筛查标记以及生物治疗的靶点,研究热门的microRNA有望成为新的研究目标。本研究选择miR-107作为研究对象,主要通过体内外实验来评估miR-107在透明细胞肾癌中的作用效果,并进一步探讨其在肿瘤中发挥作用的机制。材料与方法：通过qRT-PCR检测miR-107在52对透明细胞肾癌组织及对应癌旁组织中中表达水平的不同,并进一步在三种肾细胞系786-0, ACHN和HKC中验证表达的差异性,通过转染化学合成的模拟生物体内源的rniR-107 mimics及感染重组的过表达miR-107慢病毒质粒来研究miR-107对透明细胞肾癌细胞的作用及其作用机制。为了明确在透明细胞肾癌中miR-107发挥作用的靶基因,我们在运用生物信息学预测可能的靶基因的基础上,利用荧光素酶试验以及Western Blot等方法证实了EIF5基因是miR-107发挥作用靶基因。同时通过Western Blot、qRT-PCR等手段发现p53、VHL等多个基因参与miR-107在透明细胞肾癌组织中发挥抑癌作用。结果：利用qRT-PCR的方法,发现相对于正常组织,miR-107在透明细胞肾癌组织中表达明显下调;同样地,相对于正常肾脏上皮细胞,miR-107在透明细胞肾癌细胞系中表达是明显下降。体外实验中,过表达的miR-107的透明细胞肾癌细胞的增殖及侵袭能力受到明显抑制,裸鼠体内实验证实过表达的miR-107可以抑制肾癌肿瘤的生长。miR-107对肾癌细胞发挥抑制作用的机制探索方面,miR-107能够诱导细胞周期阻滞在G2/M期。证实了在透明细胞肾癌中EIF5是miR-107发挥作用的靶基因,Notch2、NF1以及VEGFA是miR-107潜在的可能的靶基因,p53和VHL等基因共同参与调节miR-107表达水平。结论：在多种基因参与调节下,miR-107以EIF5作为靶基因在透明细胞肾癌中,通过诱导细胞周期阻滞在G2/M期,从而发挥抑制肾癌细胞增殖及侵袭,影响肿瘤生长的作用。
【图文】：

明细胞,转染,细胞周期,透明细胞

解放军医学院博±学位论文逡逑调ｔｒＷ及细胞周期情况。从图５Ａ可Ｗ看出，相对于转染了邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎ仕0１的７８６－０逡逑细胞来说，转染了邋ｍｉＲ－１０７邋ｍｉｍｉｃｓ的细胞周期在Ｇ２Ｍ峰值上有明显差异，，通过逡逑统计软件ＳＰＳＳ的统计分析可Ｗ看出（图５Ｂ）在Ｇ２Ｍ期细胞的百分率方面有明逡逑显统计学差异，公＜０．０５；转染了邋ｍｉＲ－１０７邋ｍｉｍｉｃｓ的细胞是ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ组细胞逡逑在Ｇ２Ｍ期百分数的２．１９倍。据此可Ｗ证实过表达ｍｉＲ－１０７的肾癌细胞发生了明逡逑显的周期阻滞，ｍｉＲ－１０７可Ｗ诱导透明细胞肾癌细胞发生周期阻滞，将细胞周期逡逑阻滞在Ｇ２Ｍ期。而另一方面，在细胞调亡方面，我们也做了一定的探索，同样逡逑的将透明细胞肾癌７８６－０细胞系随机分为两个组，即转染ｍｉＲ－１０７邋ｍｉｍｉｃｓ组和转逡逑染ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ组，在转染后的４８小时，收细胞利用流式细胞仪测定细胞调亡，逡逑由图５Ｃ和Ｄ可Ｗ看出，两组之间在细胞调亡方面没有明显的差异，利用统计学逡逑软件分析两组间细胞调亡率

酶试验,基因,位点,生物信息学

ｍ化－１０７在肾癌中发挥重要作用的靴基因，我们Ｗ邋ｐｓｉuQＥＣＫＴＭ－２质粒为载体，逡逑在软件预测ＥＩＦ５可能的靴基因位点为指导，在ＥＩＦ５的３’－ＵＴＲ区的３２－３９位点和逡逑３５５５－３５６２位点构建了相应的突变体（图７Ａ和Ｃ），利用Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｍｓｅ？双巧逡逑光素酶报告基因检测系统，由图７Ｂ和Ｃ可Ｗ看出，在３２－３９位点和３５５５－３Ｗ２逡逑两个位点，ｍｉＲ－１０７对￡阳５均有＾定的抑制作用。在３２－３９位点，巧光素酶活性逡逑被抑制了邋４５．９％邋（孤＝０．７０＆＾＜０．0巧，而在３５５５－３５６２位点巧光素酶活性被抑制了逡逑１６．８％邋（ＳＤ邋＝邋０．０９８，邋０．０／＜ｐ邋＜０．０５）。因此可Ｗ明确ＥW'５是ｍ化－１０７在透明细胞肾逡逑５８逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.11

【参考文献】