肾组织CD36的棕榈酰化修饰对高脂饮食诱导的小鼠肾脏损害的影响

发布时间：2020-01-28 00:28

【摘要】：目的:脂肪酸转运酶(CD36)在长链脂肪酸的跨膜转运及代谢性炎症的发生发展中扮演着至关重要的角色。许多的研究证实肾脏的多种病变都伴随着其组织细胞中CD36的表达的升高。近年来,糖尿病肾病的患病率逐渐增高,学者们对于其发病机理进行了研究,结果提示近端肾小管上皮细胞的凋亡和变性与CD36的表达息息相关。棕榈酰化是蛋白翻译后修饰中的一种,本文研究的CD36也可以被棕榈酰化修饰,我们课题组前期研究发现CD36的棕榈酰化修饰异常增加可以促进肝、脂肪等组织的炎症、脂质异常的积聚、细胞的凋亡等损害,但是是否与肾脏疾病相关却罕有报道。因此,本研究拟在探讨CD36的棕榈酰化修饰与肾脏疾病的关系及其分子机制的研究。方法:第一部分:选取C57BL/6J小鼠为实验动物,对其进行随机分组,分别通过尾静脉注射3种不同的慢病毒,第一组为空病毒(NC),第二组为野生型过表达CD36的病毒(WTOE),第三组为CD36四个棕榈酰化修饰位点突变的病毒(AASS)。上述实验小鼠都给予高脂饮食(High fat diet,HFD)喂养两个月。收集小鼠的24h尿量,血清和肾脏组织,检测小鼠尿液中β2微球蛋白(β2-microglobulin,Β2-MG)、24h尿蛋白(urinary albumin,24h UPRO),用CD36免疫组化和Western Blot的方法检测了小鼠肾组织CD36的表达,肾组织CD36的棕榈酰化修饰水平的情况采用酰基-生物素置换的方式来评估。HE染色被应用来观察肾组织形态学,F4/80免疫组化用来观察肾组织炎症浸润情况,RT-PCR被用来检测小鼠肾组织炎症因子、趋化因子的表达。实时荧光定量PCR、天狼星红染色、TGF-β和α-SMA免疫组化检测小鼠肾脏组织纤维化情况。第二部分:HK2细胞分别转染3种不同的慢病毒,第一种为空病毒(NC),第二种为野生型过表达CD36的病毒(WTOE),第三种为CD36四个棕榈酰化修饰位点突变的病毒(AASS)。利用一定浓度的嘌呤霉素筛选细胞一段时间后,存活的细胞即为稳定细胞系。HK2细胞及其相关的稳定细胞系(人肾小管上皮细胞)及HMC细胞(人肾脏系膜细胞)给予棕榈酸(Palmitate acid,PA)处理,ABE法被用来评估体外模型中CD36的棕榈酰化修饰水平,用Western blot检测Jun N-terminal kinase(JNK)的磷酸化及NF-κB的表达,实时荧光定量PCR被用来检测细胞炎症因子、趋化因子、纤维化因子的表达。第三部分:本文中脂筏的提取采用去垢剂抵抗(DRMs)的方式。超速离心分离出脂筏结构后,Western Blot被用来检测HK2稳定细胞系中CD36在脂筏中的分布,选取棕榈酸(0.16mmol/L PA)或协同加用棕榈酰化抑制剂2-BP处理HMC细胞后,检测了上述细胞中CD36在脂筏中的分布。选取免疫共沉淀法评价体内外模型中二聚体(TLR4/CD36)的结合情况。结果:第一部分:在WTOE组小鼠中,肾脏CD36的棕榈酰化水平增高,尿量增加,尿β2微球蛋白和24h尿蛋白含量明显增多,与NC组的相比有统计学差异,P0.05;HE和天狼星红染色,F4/80,TGF-β及α-SMA免疫组化结果和RT-PCR结果显示:WTOE组小鼠肾脏组织与NC组小鼠比较,有炎症浸润,纤维化程度明显(p0.05);而AASS组小鼠与WTOE组小鼠相比,肾脏CD36的棕榈酰化水平降低,尿量减少,尿β2微球蛋白和24h尿蛋白含量明显减少,肾组织炎症浸润和纤维化程度也是减轻的(p0.05)。第二部分:体外实验中,WTOE组细胞CD36的棕榈酰化修饰水平较NC组增加,AASS组细胞CD36的棕榈酰化修饰水平比WTOE组的降低。采用突变或抑制剂处理皆可以降低修饰水平,WTOE组细胞JNK的磷酸化水平和NF-κB均较NC组增高,炎症因子、趋化因子及纤维化因子均较NC组表达高(P0.05);而AASS组细胞JNK的磷酸化信号水平和NF-κB激活情况均较WTOE组降低,炎症因子、趋化因子及纤维化因子也比WTOE组细胞表达降低(p0.05)。第三部分:体外试验中Western blot脂筏的结果显示,WTOE组细胞中CD36在脂筏结构的分布比例多于NC组中CD36在脂筏结构中的分布比例,而采用突变(AASS)或者抑制剂(2BP)处理均可降低CD36在脂筏结构中的分布。体内外实验中,WTOE组细胞中CD36和TLR4形成共聚体比NC组增多,而采用突变(AASS)或者抑制剂(2BP)处理后均可降低CD36与TLR4形成共聚体(P0.05)。结论:CD36过表达后,棕榈酰化修饰程度增加,小鼠肾脏炎症浸润加重,纤维化程度加重。而采用抑制剂或突变的方法干预CD36的棕榈酰化可以减少CD36在脂筏里的定位,影响与TLR4形成共聚体,减少JNK的磷酸化,降低NF-κB的激活,降低体内外炎症水平,减轻肾损伤。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692

【参考文献】