PC-1协同CHIP调控前列腺癌细胞中AR蛋白稳定性的分子机制研究

发布时间：2020-02-07 14:22

【摘要】：前列腺癌是男性多发的恶性肿瘤，且其在全世界的发病率呈逐年上升的趋势。早在1941年，雄激素在前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）中的作用首先是由Huggins等阐述的。他们注意到前列腺肿瘤的体积在去除雄激素之后缩小。从此之后，去除雄激素已经成为了治疗早期前列腺癌的主要方法。在治疗的初期，，由于引发细胞凋亡，肿瘤的质量不断的减小。然而不幸的是，前列腺癌通常在治后的18 36个月中复发，并且恶化成为去势抗性的前列腺癌(Castration-resistantprostate cancer,CRPC)。在CRPC中，雄激素受体（Androgen Receptor，AR）的状态因雄激素处于去势的水平下而活化，通常也伴随着AR的表达量亦开始上升，通常此时的AR对雄激素高度地敏感，且AR的活性能被一些非经典通路所激活，或者是处于组成型的激活状态。迄今为止，临床上针对前列腺癌的治疗尚没有突破性的进展。因此，探究并阐明前列腺癌细胞的生长过程中其复杂的分子机制，并且提出靶向有效的诊断、治疗方法，将是目前及未来亟待解决的科学问题。 雄激素受体AR是类固醇激素受体家族的一员，该家族的其他成员还包括雌激素，孕酮，盐皮质激素以及糖皮质激素。AR能够通过调控细胞存活、增殖、分泌作用及凋亡，在前列腺、良性的前列腺增生以及前列腺癌的恶性程度进展中发挥重要的作用。雄激素受体AR是一个由919个氨基酸组成的蛋白，基因全长约180kb，位于编号为Xq11-12的染色体上。AR是由三个主要的功能区域组成的。其中最大的氮端区域(N-terminal domain,NTD)包含了半数以上的受体部分，并且含有两个激活功能区(activation function,AF)之一。AR中的第二个功能域是DNA结合区域(DNA binding domai,DBD)，其中包含了两个锌指结构。另一个转录激活配体结合区(ligand binding domain,LBD)通过一段短的灵活的肽序列构成的铰链区与DBD连接。 PC-1基因(Prostate and Colon gene1)是由周建光研究员等筛选并且克隆出的新基因，该基因的表达量在雄激素依赖的、非转移的早期前列腺癌细胞系LNCaP中较低，而在雄激素非依赖的、可转移的晚期前列腺癌细胞系C4-2中较高。PC-1蛋白由224个氨基酸组成，属于TPD52（Tumor Protein D52）癌蛋白家族，PC-1与D52家族的蛋白高度同源的序列有180个氨基酸，位于C端，而PC-1蛋白的特异性区域则是其位于N端的46个氨基酸。前期研究提示我们，PC-1基因在前列腺癌中所发挥的特异性的作用可能源于其癌基因的身份。然而，目前对于PC-1发挥生物学功能详细的分子机制，以及其在前列腺癌临床治疗中的作用尚不明确。因此在本文中，为了探究在前列腺癌细胞中PC-1基因的表达在其发生发展的过程中所起的作用及其分子机制，我们进行了系列实验，并取得了以下的几项进展： （1）首先在非前列腺癌细胞293T瞬时转染PC-1与AR质粒，通过western blot检测到PC-1与AR蛋白量之间的相关性：PC-1过表达时，AR蛋白量降低，且呈剂量效应。然后，构建过表达PC-1的雄激素依赖的前列腺癌LNCaP稳定细胞系及敲低PC-1表达的雄激素非依赖的前列腺癌C4-2稳定细胞系，再次验证了PC-1与AR蛋白表达量呈负相关性。接着，用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)来抑制AR的蛋白合成后发现在PC-1存在时能使AR蛋白的半衰期缩短。所以从蛋白降解经典通路泛素-蛋白酶体通路角度研究，AR蛋白的泛素化实验证明了PC-1是通过蛋白酶体通路来调控AR蛋白水平的。 （2）为探究PC-1与AR之间的相关性是否是通过两者间直接的相互作用导致的。通过GST-pull down实验及免疫共沉淀实验发现外源或Qg源表达的PC-1与AR之间均存在蛋白质之间的相互作用，且能与PC-1发生相互作用的区段是AR的第629-634位的铰链区。 （3）上述结果表明，PC-1是通过与AR的第629-634位的铰链区发生蛋白质间相互作用，最终通过蛋白酶体通路来调控AR蛋白水平的。相关体外实验也证实了CHIP(carboxy terminus of Hsc70interacting protein，C末端Hsp/Hsc70交互作用蛋白)能够发挥E3泛素连接酶的作用。为研究PC-1是否是通过CHIP这一新的E3泛素化连接酶来调控AR的蛋白量有待研究。通过GST-pull down实验及外源、内源免疫共沉淀实验，分别从正向或反向检测到PC-1、CHIP及AR三者之间存在蛋白质之间的相互作用，并且PC-1过表达能增强AR和CHIP蛋白之间的相互作用，进而增强CHIP参与的AR泛素-蛋白酶体降解的过程。 （4）通过在293T细胞中外源转染PC-1、AR和CHIP质粒，进行western blot实验从蛋白量水平上，研究发现在PC-1与CHIP共同协作时，AR的蛋白量比它们单独存在时要低。且将293细胞的内源性CHIP蛋白通过RNAi技术敲低后，过表达PC-1不能使AR蛋白量下降。利用AR蛋白泛素化实验，证明PC-1能促进CHIP介导的AR的泛素-蛋白酶体降解过程。 （5）本实验室的前期研究发现PC-1能够在细胞周期G2/M期中高表达。通过诺考达唑(Nocodazole)、2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)将细胞进程阻滞在细胞周期的G2/M期时，PC-1过表达能使AR与CHIP蛋白量的降低程度增加。表明，PC-1能够协同CHIP参与G2/M期AR的降解。然而具体的作用机制尚未清楚，有待进一步研究。 （6）用LNCaP和PC3作为前列腺癌细胞模型,进行双荧光素酶报告基因实验，以研究PC-1能够发挥的生物学意义。结果表明，PC-1能够抑制AR的转录激活功能。 总之，本研究从分子水平上研究了PC-1基因在前列腺癌的发展中所起的作用及机制。为确立PC-1基因作为前列腺癌新的治疗靶标提供了分子生物学基础。
【图文】：

本实验室前期研究提示我们，PC-1 与 AR 之间可能存在着某种必然的联系为此，进行如下的实验进行验证。1.1 293 细胞中 AR 与 PC-1 蛋白相关性的验证为了初步鉴定 PC-1 与 AR 蛋白之间是否存在相关性，首先在 293 细胞中瞬时转染质粒 Myc-AR 与 HA-PC-1 或 HA 空载体，提取蛋白，进行 western blot 检测 AR 及 PC-1 的蛋白量，以γ-tubulin 为内参，结果如图 1.1A，PC-1 过表达的情况下，AR 蛋白量降低。为进一步研究 PC-1 对于 AR 蛋白量的影响，将一定量Flag-AR 及梯度剂量的 HA-PC-1 转染进 293 细胞中，提取蛋白，检测 AR 及 PC-的蛋白量，结果如图 1.1B，再次印证，PC-1 高表达能够调控 AR 蛋白表达水平且发现 PC-1 的这种作用具有浓度梯度效应。A B

硕士学位论文LNCaP稳定细胞系，以及PC-1敲低表达的C构 建 好 的 pCDH-EF1-Myc-PC-1-PuroMCS-Puro，PC-1 shRNA及对照质粒pSIH1出慢病毒后分别感染前列腺癌LNCaP和C4-2提取总蛋白，用Western印迹检测细胞内P ， 结 果 见 图 1.2 。 相 对 于 各 自 的 对PC-1-Puro慢病毒的LNCaP细胞中的PC-1蛋 shRNA慢病毒的C4-2细胞中的PC-1蛋白表CaP-Control、LNCaP-PC-1、C4-2-Control、
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

【参考文献】

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1 顾方六;Changing constituents of genitourinary cancer in recent 50 years in Beijing[J];Chinese Medical Journal;2003年09期

本文编号：2577207