黄芪甲苷通过MAPK信号通路对肾小管间质纤维化的作用及其机制研究

发布时间：2020-02-20 03:42

【摘要】：肾脏纤维化是慢性肾脏病进展的主要病理生理因素，可缓慢、进行性发展至终末期肾脏病，给社会及家庭带来沉重的经济负担。黄芪甲苷(Astragaloside IV,AS-IV)是中药黄芪的主要有效成分之一，临床实践及现代药理提示黄芪对延缓慢性肾脏病进展具有显著作用[1]。目前黄芪甲苷对肾纤维化的作用尚不明确，本研究围绕黄芪甲苷对肾纤维化的作用机制进行探讨。目的：明确黄芪甲苷对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型发生肾脏纤维化的干预作用，明确黄芪甲苷对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞损伤的作用，并初步探讨其作用机制。方法：雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组（Sham组）（n=8）、模型组（UUO组）（n=10）、黄芪甲苷干预组（AS-IV组）（n=10）。模型组和黄芪甲苷干预组均采用单侧输尿管结扎（UUO）建立肾纤维化模型，Sham组不做输尿管结扎余操作相同。黄芪甲苷干预组在术后当天及其后连续7天给予AS-IV20mg/(kg×d)灌胃，Sham组及UUO组小鼠同时给予等量溶剂灌胃。分别于术后第7、14天采集双侧肾组织标本，记录肾重及体重。肾组织切片行HE、MASSON染色，观察病理改变情况。采用TUNEL法检测肾组织的细胞凋亡情况。采用蛋白质免疫印迹（western blotting）及实时定量荧光PCR（real-time PCR）法，分别检测纤连蛋白(fibronectin)、collagen IV、α-SMA、TGF-β1表达，并western blotting观察p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK MAPK蛋白表达情况。体外培养人肾小管上皮细胞株（HK2），分为正常组（Ctl）、模型组（TGF-β1）、黄芪甲苷干预组（AS-IV）。模型组和干预组均采用TGF-β1（10ng/ml）刺激细胞，干预组同时加入不同浓度的AS-IV（50,100,200ug/ml），刺激后12,24,48h收集各组细胞。提取细胞蛋白样品，western blotting检测纤连蛋白、collagen IV、α-SMA表达情况。CCK8法检测细胞活性，TUNEL法检测细胞凋亡，并检测p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK MAPK信号蛋白表达水平。进一步研究提前30分钟给予SB203580(10μM)抑制p38磷酸化，探讨并对比其与AS-IV对肾小管上皮细胞的保护作用。结果：术后第14天UUO组小鼠梗阻侧的肾重/体重比值（KW/BW）较对侧显著下降（P0.05），而AS-IV干预后可缓解KW/BW的缩小（P0.05）。与Sham组相比，术后第14天梗阻侧肾脏的病理学表现出多处肾小管间质纤维化改变，同时检测发现，UUO组第14天梗阻肾组织纤连蛋白、collagen IV、α-SMA、TGF-β1蛋白及mRNA表达增多（均P0.05），AS-IV组梗阻侧肾脏纤维化改变显著减轻（P0.05），纤连蛋白、collagen IV、α-SMA、TGF-β1表达量较模型组减少（均P0.05）。UUO组梗阻侧肾脏细胞凋亡较Sham组显著增加（P0.05），术后14天AS-IV组的细胞凋亡程度较UUO组减轻（P0.05）。UUO组p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK MAPK均表达增高（均P0.05），而黄芪甲苷干预显著改善MAPK信号蛋白的激活（均P0.05）。 TGF-β1刺激后出现细胞活性下降（P0.05），细胞凋亡增多（P0.05），纤连蛋白、collagen IV、α-SMA表达水平增高（均P0.05），p-p38/p38、p-JNK/JNK蛋白表达增多（均P0.05），，而p-ERK/ERK未见明显改变。而黄芪甲苷干预可显著改善细胞活性（P0.05），减少细胞凋亡的发生（P0.05），减少纤连蛋白、collagen IV、α-SMA蛋白表达（均P0.05）。同时AS-IV干预降低p-p38/p38、p-JNK/JNK水平（均P0.05）。提前给予SB03580抑制p38磷酸化，同样表现出collagen IV、α-SMA表达的减少（均P0.05）。结论：AS-IV可改善UUO和TGF-β1诱导的肾小管间质纤维化进展和减少细胞凋亡。黄芪甲苷的抗纤维化作用，可能是通过抑制p38、JNK MAPK信号通路活化，减少肾小管上皮细胞的凋亡，进而发挥改善肾小管间质纤维化的作用。
【图文】：

黄芪甲苷,化学结构

护神经细胞[13]。黄芪甲苷抑制猪血清诱导的肝纤维化，胶原蛋白合成，降低肝 TGF-β1 表达，抑制星状细胞过度增来越多的研究指出，黄芪甲苷在各种肾损伤模型中具有特i 等发现[16]，黄芪甲苷可改善肾缺血再灌注及顺铂诱导的急激反应，减少细胞凋亡，从而产生肾保护作用。Qi 等[17小管上皮损伤，黄芪甲苷干预可特异性减轻肾近端小管细善小管间质纤维化的发生。我们的前期实验研究证实[20]细胞分泌 TGF-β1，促进肝细胞生长因子及其受体（c-m管上皮细胞凋亡，从而减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞芪甲苷对肾小管间质纤维化的作用尚缺乏足够研究证据与肾纤维化的作用展开研究，并提出假设：黄芪甲苷可能保护作用，部分抑制细胞凋亡，改善后期肾小管间质纤维

黄芪甲苷,肾纤维化,机制,丝裂原活化蛋白激酶

上海交通大学硕士学位论文(c-jun N-terminal kinase, JNKs)和 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (p38 MAPK)。JNK和 p38 MAPK 信号被认为可能是参与肾纤维化进程的重要通路[23, 24]。在小鼠肾动脉狭窄的模型中[25]，使用 SB203580（p38 MAPK 抑制剂）可有效抑制肾纤维化的进展。因此，本研究提出假设：黄芪甲苷对肾小管的保护作用，是否通过调节 MAPK 信号通路起作用？黄芪甲苷是否通过 MAPK 通路改善肾纤维化？（见图 2）
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692

【参考文献】