RCAS1表达异常对前列腺癌生物学行为的影响

发布时间：2020-03-11 15:42

【摘要】：目的:研究RCAS1含量升高或降低对于Pca细胞生物学行为的影响,揭示RCAS1在Pca发生、进展中的作用,初步判断RCAS1在Pca早期诊疗中的临床应用可能,并积极探索RCAS1靶向基因治疗的价值。方法:体外培养PC3、LNCaP、C42、DU145等前列腺癌常见细胞系,并通过qPCR及Western Blot检测RCAS1表达状态,筛选RCAS1高、低表达细胞系。构建RCAS1高表达质粒RCAS1-high并通过基因测序技术确定质粒无突变,将RCAS1-high瞬时转染RCAS1低表达细胞系,应用qPCR及Western Blot半定量RCAS1表达量,确定RCAS1-high可在细胞内完整表达。购买吉玛公司shRCAS1质粒套餐,筛选出RCAS1高表达细胞并瞬转,48h后使用qPCR及Western Blot半定量RCAS1表达量并最终筛选出抑制效应最强的shRCAS1。使用最终确定的shRCAS1及构建成功的RCAS1高表达质粒分别瞬时转染RCAS1高、低表达细胞系,24-48h后应用muse仪检测RCAS1-high及shRCAS1对于Pca细胞凋亡、周期方面的改变;使用MTT法检测RCAS1-high及shRCAS1对于Pca细胞增殖能力的改变;应用transwell法测定RCAS1-high及shRCAS1对于Pca细胞侵袭能力的改变。结果:1、在PC3细胞系中,RCAS1 mRNA及蛋白表达量最低;LNCaP细胞系中,RCAS1 mRNA及蛋白表达量最高,C42中RCAS1 mRNA及蛋白表达量与LNCaP相差不大;2、分别于LNCaP、C42细胞系转染shRCAS1-406、、shRCAS1-561、shRCAS1-598、shRCAS1-690、shRCAS1-NC、shGAPDH,通过qPCR及Western Blot技术筛选出RCAS1抑制作用最强的质粒为shRCAS1-406;3、以pFLAG-CMV为基础质粒构建RCAS1高表达质粒RCAS1-high,通过双酶切及基因测序鉴定插入片段大小正确、序列无突变,转染PC3细胞48h后应用qPCR及Western Blot半定量RCAS1丰度,实验证实RCAS1 mRNA及蛋白表达量显著升高,RCAS1高表达质粒RCAS1-high构建成功;4、转染RCAS1-high 48h后,PC3增殖能力相比Vector组明显提高,凋亡率相比Vector组明显下降,RCAS1表达增高可促进PC3由G0/G1期转进S期,transwell实验显示PC3侵袭性增强;LNCaP、C42细胞转染shRCAS1-406后,发现RCAS1表达降低可显著抑制细胞增殖能力,LNCaP、C42凋亡增加,且G0/G1期比例相比Vector组增加,侵袭性减弱;结论:1、RCAS1在PC3中含量最低,在LNCaP、C42中含量最高;2、成功筛选出RCAS1抑制作用最强的质粒为shRCAS1-406;3、成功构建RCAS1高表达质粒RCAS1-high;4、RCAS1高表达可显著增加PC3细胞增殖能力,促进细胞侵袭,显著抑制细胞凋亡,并促进细胞由G0/G1期向S期转化;而RCAS1低表达可显著降低LNCaP、C42增殖,阻碍细胞侵袭,显著促进细胞凋亡,并促使细胞阻滞在G0/G1期。
【图文】：

天津医科大学硕士学位论文 结果结果2.1 RCAS1/EBAG9 高、低表达细胞系的确立培养 PC3、LNCap、C4-2、DU145 等四种前列腺癌细胞系，应用 qPCR 及western blot 等方法检测各细胞系中 RCAS1/EBAG9 的相对表达量，结果发现 PC3细胞系中 RCAS1/EBAG9 mRNA 及蛋白表达量最低，LNCap、C4-2 细胞系中RCAS1/EBAG9 mRNA 及蛋白表达量最高（如图 1）。因此，选择 PC3 细胞系进行 RCAS1/EBAG9 高表 达 实 验 研究 ， 选择 LNCap 、 C4-2 细 胞 系 进 行RCAS1/EBAG9 低表达实验研究。

shRCAS1-690GATGCACCCACCAGTGTAAAGTTCAAGAGACTTTACACTGGTGGGTGCATCTTGGACATGACACCAACTATTAGTTCAAGAGACTAATAGTTGGTGTCATGTCCTT因 LNCap、C4-2 细胞系中 RCAS1/EBAG9 mRNA 及蛋白表达量最高，本实验选择 LNCap、C4-2 细胞系转染 shRCAS1 质粒套餐，，其中 C4-2 细胞系转染shRCAS1 质粒套餐后荧光显微镜下观察，应用 Image J 软件融合图像后如图 2 。shRCAS1-NC shGAPDH shRCAS1-406
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.25

【参考文献】

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本文编号：2586304