Rad51在小鼠雄性生殖细胞发育过程中的作用及机制研究

发布时间：2020-03-21 16:01

【摘要】：[研究背景]近年来男性不育发生率快速增加,其中30%患者为病因不明的特发性不育(如非梗阻性无/寡精子症和严重少精子症),而且缺乏有效的治疗措施。因此,深入研究精子发生的分子机制对于阐明不育症的病因具有重要意义。精子发生过程包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子的变态分化及成熟等阶段,其受多种激素和众多基因的共同调控。减数分裂(meiosis)是形成单倍体精子细胞的重要环节,而Rad51是参与减数分裂重组修复过程中的关键蛋白。由重组酶Rad51和Dmc1催化的单链入侵、同源配对及链交换是减数分裂重组中最核心的事件。Meiosis I前期,核酸内切酶SPO11催化产生大量的程序性DNA双链断裂(double-strandedDNAbreaks,DSBs),启动减数分裂重组。DSBs形成后形成3'端单链DNA(ssDNA)尾;Rad51和Dmcl结合到ssDNA上形成核蛋白纤维,并介导ssDNA侵入同源双链区域,形成D-loop中间体。在DSBs产生后,同源染色体开始配对、联会,形成联会复合体(synaptonemal complex,SC)。SC既能维持同源染色体的配对,也能作为支架(scaffold)与Rad51和Dmcl结合,促进重组复合物形成并参与减数分裂重组过程。由于全身性敲除Rad51基因的小鼠胚胎期致死,难以利用该动物模型研究Rad51基因在精子发生过程中的作用机制。条件性基因敲除小鼠模型可以避免全身性基因敲除小鼠可能出现的胚胎致死,但目前尚无Rad51的条件性基因敲除小鼠的报道。为了探究Rad51在雄性小鼠生殖发育过程中作用及机制探究,我们开展了以下研究工作:1.Rad51在小鼠睾丸中的表达Western blotting方法证明Rad51蛋白在不同日龄小鼠睾丸组织中均有表达,其表达水平从8日龄开始升高,在42日龄时表达水平明显增加,42日龄与96日龄Rad51蛋白的表达水平无明显差异。免疫组化和Real-time PCR方法证明Rad51在小鼠睾丸生殖细胞中高表达。2.Rd51条件性敲除小鼠不育我们构建了Rad51条件型敲除小鼠,并将其与DDX4-Cre转基因工具小鼠交配,进而得到从胚胎期15天生殖细胞缺失Rad51基因的雄性小鼠。通过Western blotting和免疫组化确定敲除效果,发现Rad51fl/-;DDX4-Cre雄性小鼠的睾丸体积较对照小鼠减少2/3并出现在小鼠个体发育早期。生育力实验表明其不育。3.Rd51条件性敲除小鼠中减数分裂和精原细胞增殖受阻通过染色体铺片和睾丸组织切片免疫荧光检测联会复合体蛋白(SCP-3)和DNA损伤相关蛋白(γ-H2AX),发现在Rad51fl/;DDX4-Cre小鼠中减数分裂过程受阻。采用免疫荧光和免疫组化对增殖相关蛋白Ki-67染色检测生殖细胞增殖,发现在Rad51f/-;DDX4-Cre小鼠中Ki-67表达受损。接下来我们探索精子发生早期精原细胞有丝分裂阶段PLZF表达情况的分析显示PLZF不表达,精原细胞有丝分裂过程受阻。4.检测Rad51条件性敲除小鼠曲细精管中支持细胞因为Rad51fl/;DDX4-Cre小鼠睾丸曲细精管中只含有一层细胞,且精原细胞有丝分裂过程受阻,通过对支持细胞标记物SOX9免疫荧光和免疫组化染色证明了Rad51fl-;DDX4-Cre小鼠睾丸曲细精管中只含有支持细胞,对支持细胞数目的统计学分析发现支持细胞数目明显增多;透射电镜观察法观察支持细胞形态异常,细胞延伸至曲细精管管腔中部,但内部的细胞器未发现异常。5.Rad51fl/;凰DX4-Cre小鼠生殖细胞有较高的DNA损伤并且对X射线敏感性增加Rad51fl/;DDX4-Cre小鼠和对照组小鼠照射4GyX射线并释放24小时,检测γ-H2AX结果表明与对照小鼠相比,Rad51fl/+;DDX4-Cre小鼠本底有较高的DNA损伤且睾丸组织对X射线更敏感。
【图文】：

时间点,过程,有丝分裂,生殖细胞

发生过程是由二倍体的配子经过分化发育为单倍体精子的过程，，在精子发生中，逡逑二倍体的雄性原始生殖细胞（ＰＧＣ）经过有丝分裂、减数分裂和分化最终形成成逡逑熟精子，该过程受众多基因和激素的共同调控，精子发生过程（图１）包括原始逡逑生殖细胞（ＰＧＣ）特化、迁移和增殖；性原细胞有丝分裂、静息和迁移；精原细逡逑胞有丝分裂；精母细胞减数分裂和成熟精子形成

微镜,野生型,箭头,精母细胞

龄与９６日龄Ｒａｄ５１蛋白的表达水平无明显差异（如图３）。逡逑为明确Ｒａｄ５１在小鼠睾丸组织的表达和定位，我们取野生型成年雄鼠的睾丸逡逑组织，经石蜡包埋、组织切片，进行ＨＥ染色（图１Ａ）和免疫组化染色（图１Ｂ），逡逑图１Ａ中可明显看出曲细精管中含大量的支持细胞（红色箭头）、精原细胞（黄逡逑色箭头）、精母细胞（黑色箭头）、精细胞（绿色箭头），并且Ｒａｄ５１主要在生殖逡逑细胞的细胞核中大量表达（图１Ｂ）。逡逑以上结果表明从小鼠出生８天开始，精母细胞开始进入减数分裂阶段，Ｒａｄ５１逡逑在第一波生精减数分裂的过程中开始大量表达，在第一波生精波（３５天）完成逡逑后Ｒａｄ５１表达量维持在稳定的水平。这提示Ｒａｄ５１在精子发生过程中可能起着逡逑重要的作用。逡逑２９逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R698.2

【参考文献】