BOK对睾丸癌细胞恶性生物学行为的影响及可能机制的研究

发布时间：2020-03-22 00:06

【摘要】：背景:睾丸癌(Testicular cancer,TC)是15-34岁年轻男性最常见的恶性肿瘤,其5年生存率超过95%,目前认为睾丸癌属于“可治愈”的恶性肿瘤疾病。睾丸肿瘤分为生殖细胞肿瘤和非生殖细胞肿瘤,其中以生殖细胞肿瘤(germ cell tumor/GCT)居多,超过95%。睾丸肿瘤的发病原因尚不清楚,其危险因素包括:隐睾或睾丸未降(睾丸发育不全综合征),Klinefelter综合征等,家族遗传因素,对侧睾丸肿瘤和不孕不育。近年来的研究发现,B-cell lymphoma 2 ovarian killer(BOK)作为一种促凋亡蛋白,在恶性肿瘤中起肿瘤抑制作用。截至目前,有关BOK蛋白在睾丸癌中的研究文献报道较少,其具体生物学作用目前仍不清楚。目的:本研究应用免疫组织化学及蛋白质印迹的方法来检测BOK蛋白在10例睾丸癌及癌旁组织中的表达情况,通过BOK过表达及敲低的方法进一步研究其有关生物学行为及可能的机制。研究方法:1、本研究收集2014年至2016年期间于上海长征医院泌尿外科行外科手术切除,经病理专家证实为睾丸癌及相应癌旁组织10例,标本通过固定包埋,HE染色后经病理医师明确诊断。2、应用免疫组织化学染色方法检测BOK抗体在睾丸癌组织及对应癌旁组织中蛋白表达情况。3、细胞培养和转染:两个TC细胞系(TCam-2和I-10)和正常睾丸Hs1.Tes购自美国典型培养物保藏中心,在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素钠、100 mg/ml链霉素的DMEM和F-12K培养基中培养。当细胞生长达到50-70%汇合时,使用DNA转染试剂转染细胞。4、Western blot分析:使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳提取总蛋白质,然后转移到硝酸纤维素膜上。印迹膜与1:500稀释的BOK抗体或胱天蛋白酶-3/裂解的半胱天冬酶-3抗体一起温育。洗涤后,将膜与辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔1:2000稀释液一起温育。使用Eas ySee Western印迹试剂盒进行测定。5、CCK8分析:转染后24小时将细胞消化,计数,接种于96孔板中,培养0,12,24,36和48小时,最后使用细胞计数试剂盒进行评估。6、Transwell侵袭实验:具有人工基底膜的8-μm孔径的通透性隔离腔用于体外侵袭实验。细胞被消化并计数。将100μl共1×10~5个细胞铺于上部室中,并将500μL补充有10%FBS的培养基作为化学引诱物覆盖于底部室上。4%多聚甲醛固定底部上的非迁移细胞,并用0.1%结晶紫染色15分钟。在显微镜下以×400放大倍数计数细胞。7、TUNEL检测:将TCam-2和I-10细胞在12孔板中培养24小时,用冷P BS洗涤并用4%多聚甲醛固定。使用一步法TUNEL凋亡测定试剂盒进行测定。细胞核中的凋亡细胞显示绿色荧光。8、统计分析:用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。所有数据均以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示。假设双侧独立方差,采用双侧t检验和方差分析对各组间的平均值进行统计。P0.05被认为具有统计学意义。结果:1、与癌旁组织相比,BOK主要在正常细胞中表达,并且在睾丸癌组织中显著下调。通过RT-PCR和Western blot分别验证了BOK mRNA和蛋白的表达。结果与免疫组织化学染色的结果一致(p0.001)。2、BOK过表达抑制TC细胞增殖和侵袭,BOK敲低促进TC细胞增殖和侵袭。首先用Western blot检测了两个TC细胞系和正常睾丸细胞中BOK的表达水平。Western blot证实了BOK过表达质粒的有效性。进行CCK8测定和体外侵袭实验以检测细胞增殖和侵袭。结果显示BOK过表达抑制TCam-2和I-10细胞的增殖和侵袭。在TCam-2和I-10细胞中转染siRNA并进行Western印迹以证实siRNA的作用。siRNA转染后BOK的表达显著降低。BOK敲低后细胞增殖和侵袭能力增强。这些数据支持BOK在TC中起肿瘤抑制的作用。3、BOK过表达促进睾丸癌细胞凋亡。我们进行Western blot检测caspase-3/裂解的cas pase-3,TUNEL检测过表达BOK的TCam-2和I-10细胞中的DNA裂解。结果显示,当TCam-2和I-10细胞过度表达BOK时,出现裂解的半胱天冬酶-3。BOK过表达显著增加TUNEL阳性细胞。这些数据表明BOK通过诱导细胞凋亡抑制TC细胞增殖。结论:1、与癌旁组织相比,BOK在睾丸癌组织中频繁下调。2、BOK过表达抑制睾丸癌细胞增殖和侵袭。相反,BOK敲低促进睾丸癌细胞增殖和侵袭。3、BOK过表达促进睾丸癌细胞凋亡。
【图文】：

表图,睾丸癌,蛋白质水平

新乡医学院硕士学位论文3 结果.1 BOK 在睾丸癌细胞中低表达考虑到 BOK 在生殖组织中显示出限制性表达并且在人类癌症中经常缺失，我过免疫组织化学染色检测了 10 个配对的初级 TC 和癌旁组织标本中 BOK 的表图 1A）。结果表明，与癌旁组织相比，BOK 主要在正常细胞中表达，并且在睾组织中显著下调。另外，通过 RT-PCR 和 Western blot 分别验证了 BOK mRNA白的表达（图 1C 和 1B）。结果与免疫组织化学染色的结果一致（P<0.001）。

细胞增殖,过表达

21图 2：BOK 过表达抑制 TC 细胞增殖和侵袭，并且 BOK 敲低促进 TC 细胞增殖和侵袭。（A）通过 Western 印迹检测不同 TC 细胞中的 BOK 表达。（B）通过 Western来检测 OE-BOK 和 siRNA-BOK 的表达。（C）通过 CCK8 检测 BOK 过表达或敲低后 TCam-2 和 I-10 细胞的增殖。（D）通过 Transwell 检测 BOK 过表达或敲低后 TCam-和 I-10 细胞的侵袭(Bar=50 μm)。*P <0.05。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.21

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