CNF1激活Cdc42-PAK1信号轴促进前列腺癌的研究

发布时间：2020-03-22 01:30

【摘要】：目的:尿路致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)是尿道感染(urinary tract infections,UTIs)的主要致病因素,UPEC诱发的UTIs可以导致膀胱炎,肾盂肾炎和前列腺炎,并且在前列腺癌(prostate cancer,PCa)的发生发展中起到重要作用。然而,UPEC促进前列腺癌发生发展的具体机制尚不清楚。细胞毒性坏死因子1(Cytotoxic necrotizing factor 1,CNF1)是UPEC的重要毒素蛋白,它在前列腺癌进展中的作用目前尚未报道。监控和治疗携带cnf1的UPEC菌株,对于控制前列腺癌进展具有重要的临床意义。本论文拟解决以下三个问题:1.研究CNF1在体外对前列腺癌细胞的作用;2.研究CNF1在体内对前列腺癌的作用;3.探讨CNF1对前列腺癌作用的具体分子机制。方法:1.利用镍柱纯化UPEC11菌株来源的CNF1蛋白,通过细胞划痕、Transwell迁移和侵袭实验检测CNF1对前列腺癌细胞株在体外运动的作用。2.筛选稳定表达CNF1活性片段(CNF1c)及荧光素酶的PC3前列腺癌细胞系,构建免疫缺陷鼠的尾静脉注射模型;并且用CNF1蛋白处理稳定表达荧光素酶的22Rv1-luci细胞系,构建免疫缺陷鼠的前列腺原位注射模型。通过小动物活体成像技术监测体内转移灶,并通过HE染色和免疫组化进行验证。3.利用免疫荧光和Western blotting(WB)技术,检测CNF1是否可以进入PC3细胞内,通过Pull-down实验检测CNF1对RhoA、Cdc42和Rac1的活化影响。4.利用RhoA、Cdc42和Rac1的抑制剂以及siRNA分别检测它们在CNF1影响PC3运动中的作用。进一步瞬转野生型、活化型和失活型Cdc42表达质粒,分析Cdc42对前列腺癌细胞运动的作用。5.利用Cdc42下游效应蛋白PAK1的抑制剂检测PAK1在CNF1影响PC3运动中的作用。并利用WB技术,检测CNF1处理后,PAK1第423位苏氨酸的磷酸化水平。进一步瞬转野生型、活化型和失活型PAK1表达质粒,分析PAK1对前列腺癌细胞运动的作用。6.利用WB技术,检测CNF1处理PC3和22Rv1细胞后,MMP2和MMP9的表达水平。7.利用免疫组化技术,检测CNF1c过表达前列腺癌细胞在小鼠体内肺部转移灶中MMP9和磷酸化PAK1的表达水平。8.利用免疫组化技术,检测组织芯片中磷酸化PAK1的表达水平和组织病理分级的相关性。9.利用镍柱纯化其它UPEC来源的CNF1蛋白,通过Transwell迁移和侵袭以及WB实验,比较不同UPEC来源的CNF1对PC3的影响。结果:1.UPEC11菌株来源的CNF1普遍促进前列腺癌细胞在体外的迁移和侵袭。2.尾静脉注射表达CNF1c PC3细胞的免疫缺陷鼠肺部转移水平明显高于对照组;前列腺原位接种CNF1蛋白处理的22Rv1-luci细胞的免疫缺陷鼠各组织器官肿瘤转移水平也明显高于对照组。CNF1显著促进PC3和22Rv1细胞在体内的转移能力。3.CNF1进入PC3细胞内并且活化了RhoA、Cdc42和Rac1,而且CNF1对Cdc42和Rac1的作用要强于RhoA。4.Cdc42的抑制和敲低明显减弱了CNF1的促PC3迁移和侵袭能力,Rac1的抑制和敲低则完全没有影响,而RhoA的抑制和敲低也明显减弱了对照组PC3迁移和侵袭的基本能力。瞬转活化型Cdc42促进了前列腺癌细胞的迁移和侵袭。5.PAK1抑制剂削弱了CNF1的促PC3迁移和侵袭能力。而且CNF1显著促进了PAK1第423位苏氨酸的磷酸化水平。瞬转活化型PAK1促进了前列腺癌细胞的迁移和侵袭。6.CNF1促进了PC3细胞内MMP9的表达水平,对MMP2的表达水平没有影响。7.CNF1c表达的前列腺癌细胞在肺部转移灶中MMP9和磷酸化PAK1的表达水平显著提高。8.在临床样本中,随着前列腺癌组织学分级的升高,磷酸化PAK1的阳性染色百分比和表达强度也增强。9.CNF1蛋白的不同UPEC菌株来源并不影响它对前列腺癌细胞的作用,均通过相同机制显著促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭。结论:1.CNF1可以促进前列腺癌细胞在体外的迁移和侵袭能力。2.CNF1可以促进前列腺癌细胞在体内的转移能力。3.CNF1可以进入前列腺癌细胞内并活化RhoA、Cdc42和Rac1。4.CNF1通过活化Cdc42介导促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力。5.CNF1通过活化Cdc42-PAK1-MMP9信号通路促进前列腺癌细胞在体外的迁移和侵袭能力以及在体内的转移能力。6.磷酸化PAK1的表达水平和人类恶性前列腺癌病理分级呈正相关性。7.不同UPEC来源的CNF1对前列腺癌细胞具有相似的促迁移和促侵袭作用。
【图文】：

柱形图,划痕实验,透析液,迁移能力

17图 1.1图 1.1（A）划痕实验检测 PC3 细胞经透析液、LPS 和不同剂量 CNF1 蛋白处理36 h 后的迁移能力。（B）为对图 A 迁移距离的统计学分析。（C）划痕实验检测 PC3 细胞经 1 nM CNF1 蛋白、透析液、LPS 处理后不同时间的迁移能力。（D为对图 C 各时间点迁移距离的统计学分析。柱形图代表三次独立实验数据（以均数±标准差表示），，**P<0.01,（B, D）为单因素方差分析。1.2.2 纯化的 CNF1 蛋白促进前列腺癌细胞 PC3 在体外的迁移和侵袭能力，并且这一作用对前列腺癌细胞有一定的普遍性我们进一步用 Transwell 实验来验证 CNF1 对 PC3 的促迁移作用，在Transwell 的上室和下室溶液中分别加入透析液，LPS 和 1 nM CNF1 蛋白，结果

透析液,蛋白,癌细胞株,雄激素

天津医科大学博士学位论文发现在迁移实验和加 Matrigel 的侵袭实验中，与对照组相比，CNF1 蛋白处理显促进了 PC3 的迁移和侵袭能力（如图 1.2 A, B）。除了雄激素非依赖的前列癌细胞株 PC3，其它三株雄激素依赖（LNCaP 和 22Rv1）和雄激素非依赖（VCaP）前列腺癌细胞系也被 CNF1 蛋白明显促进了迁移和侵袭能力，表CNF1 促前列腺癌细胞迁移和侵袭能力具有普遍性（如图 1.2 C, D）。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.25

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