抑制SmgGDS表达通过Rac1-Nox4-ROS通路诱导肾小管上皮细胞损伤

发布时间：2020-03-22 15:06

【摘要】：研究背景肾纤维化是几乎所有不同病因的进展性慢性肾病(CKD)的共同病理特征。肾小管上皮细胞的EMT过程被认为是导致肾纤维化过程中的一环。ROS与CKD进展中纤维化的机制有关,能够诱导肾小管上皮细胞EMT以及促炎细胞因子IL-1β的产生。因此,过量的ROS被越来越多地认为是造成肾脏氧化应激损伤和促进肾小管上皮细胞EMT、炎症发展的一个重要因子。肾脏ROS的主要来源是NADPH氧化酶(Nox)生成。那么,抑制肾小管上皮细胞中Nox来源的ROS生成可能是防治肾纤维化的突破口。NADPH氧化酶4(Nox4)最初在肾脏中被发现并被鉴定为Nox的一种亚型,在肾脏中高表达。Nox由5个亚基组成:催化亚基gp91phox、跨膜亚基p22phox,胞浆亚基p47phox、p67phox和小GTP酶结合蛋白Rac1等组装成多亚基氧化酶复合体。Rac可能是Nox1,Nox2,Nox4,Nox5的催化剂。但目前对于Rac1在Nox4激活过程中的角色存在争议。小GTP结合蛋白解离刺激因子(SmgGDS)是一种能将小GTP结合蛋白从GDP结合形式变成GTP结合的形式的鸟嘌呤核苷酸交换因子。SmgGDS通过结合到Rac1的核定位信号序列,促进Rac1的核转位及蛋白酶体系统降解,以达到抑制Rac1的效果。基于Rac1在Nox家族活化过程中所起的作用,在SmgGDS的调节下,Rac1作为NADPH氧化酶生成ROS过程中一个环节,可能成为我们防治ROS产生肾损伤的新的治疗靶点。研究方法一、SmgGDS低表达HK-2细胞载体构建:接种HK-2细胞于6孔板培养板中,转染3种siRNA-SmgGDS后,提取总RNA、总蛋白,qRCR和Western blot检验SmgGDS的mRNA、蛋白表达水平。二、ROS的测定:接种HK-2细胞于6孔板培养板中,转染siRNA-SmgGDS后,加入50μM、100μM的NADPH氧化酶抑制剂Apocynin或Rac1抑制剂NSC23766预处理30min或者4h,荧光染色后用荧光倒置显微镜拍照采集荧光照片。三、Rac1、Nox4的蛋白、mRNA表达水平测定:转染siRNA-SmgGDS 36H后,加入50μM的NSC23766预处理36H,提取总蛋白,Westemblot检验Rac1、Nox4的蛋白表达水平。转染siRNA-SmgGDS 24H后,加入50μM的NSC23766预处理24H,提取总RNA,qRCR检验Nox4的mRNA表达水平。四、下游cα-SMA、E-cadherin及IL-1β的mRNA水平测定:转染siRNA-SmgGDS 24H后,加入50μM、1OOμM的NSC23766预处理24h,qRCR检验E-cadherin、a-SMA、IL-1β的mRNA水平。五、统计学方法:以上实验均在同样条件下重复3次。实验数据均采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。多组均数因素间比较时采用单因素方差分析(ANOVA)。P0.05时差异被认为有统计学意义。结果一、SmgGDS低表达HK-2细胞载体构建成功:三条siRNA-SmgGDS中的SmgGDS mRNA、蛋白表达水平与对照组相比均明显的下降。提示SmgGDS低表达HK-2细胞载体构建成功。二、SmgGDS低表达HK-2细胞诱导ROS的产生并被Apocynin和NSC23766抑制:转染siRNA-SmgGDS后的HK-2细胞诱导产生大量ROS,细胞ROS生成比较阴性对照组明显增高。转染siRNA-SmgGDS后,加入50μM、1OOμM的Apocynin或者NSC23766作用于HK-2细胞。Apocynin和NSC23766都降低了ROS的生成。并且随着Apocynin和NSC23766浓度的升高,ROS生成逐渐减少,呈浓度依赖性。该部分研究结果表明,Rac1及NADPH氧化酶在SmgGDS诱导产生ROS的机制中有着重要的作用。三、SmgGDS在HK-2细胞中通过Rac1调控Nox4的表达:对比对照组,细胞转染siRNA-SmgGDS后,Rac1蛋白水平和Nox4的mRNA及蛋白的表达水平均明显的增加。而50μM的NSC23766能降低因为转染siRNA-SmgGDS导致的Rac1、Nox4的蛋白水平升高和Nox4的mRNA水平升高。这些数据表明在HK-2细胞中SmgGDS可能通过Rac1来调节Nox4的表达。四、SmgGDS-Rac1诱导HK-2细胞EMT和炎症因子表达:转染siRNA-SmmgGDS后,α-SMA、IL-1βmRNA表达水平的增加,E-cadherinmRNA表达下降。并且使用50μM、100μM的NSC23766可以抑制因转染siRNA-SmgGDS升高的IL-1β的mRNA水平,抑制程度呈浓度依赖性。使用50μM的NSC23766可以逆转干扰SmgGDS所引起的α-SMA增加和E-cadherin下降。证明SmgGDS-Rac1通路在HK-2细胞的EMT和炎症反应中起着重要的作用。结论抑制SmgGDS的表达可以通过Rac1上调Nox4的表达,从而生成大量的ROS诱导HK-2细胞EMT和炎症因子表达。
【图文】：

ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ邋组与邋ｓｉＲＮＡ－ＮＣ邋相比干扰效率分别为邋８５．２３％、６７．３５％、７４．５１％。逡逑三条ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ中的ＳｍｇＧＤＳ邋ｍＲＮＡ表达水平与ＳｉＲＮＡ－ＮＣ组相比均明逡逑显的下降（？？＜0．０５，图１－Ａ）。进一步Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ实验结果显示：与ｑＰＣＲ逡逑结果一致，经过ｓｉＲＮＡｌ，ｓｉＲＮＡ２和ｓｉＲＮＡ３转染细胞后，细胞的ＳｍｇＧＤＳ蛋逡逑白表达受到明显的抑制，ＳｍｇＧＤＳ蛋白在ｓｉＲＮＡｌ，邋ｓｉＲＮＡ２，邋ｓｉＲＮＡ３和阴性对逡逑照组邋ｓｉＲＮＡ－ＮＣ邋的相对表达量分别为邋０．２９７±０．０９１，０．３７６±０．１００，０．３５９±０．１５５，逡逑０．６５４±０．２０６，差别具有统计学意义（ＰＣ０．０５，图邋１－Ｂ）。说明邋ｓｉＲＮＡｌ，邋ｓｉＲＮＡ２逡逑和ｓｉＲＮＡ３均为有效转染序列，能在人肾小管上皮细胞中有效沉默ＳｍｇＧＤＳ的逡逑ｍＲＮＡ及蛋白表达，提示ＳｍｇＧＤＳ低表达人肾小管上皮细胞载体构建成功。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑＜邋１．５－逡逑笔逡逑１．０－邋：逡逑？逦ＳｍａＧＤＳ逦前ｉｌｍｔｌｉｌｐ逡逑｜逦匕邋Ｌ—邋逦———逡逑ｉ邋０．５－逦＊逡逑ｇ逦＊逦ｇａｄｐｈ邋ｍｍｍ邋ｍｍｍ邋■ｗｉｉｂｉｍｗｉ邋ｍｍｍｍ逡逑属。。１＾１逦ｓｉＲＮＡｌ邋ｓｉＲＮＡ２邋ｓｉＲＮＡ３邋ｓｉＲＮＡ－ＮＣ逡逑Ｃ邋１０１逡逑卜逦Ｔ逡逑Ｓ邋０．６－逦＊逡逑ｌ：：ｌｉ邋ｉｌｌ逡逑图１：转染ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ后

照组细胞ＲＯＳ生成很少且荧光强度比较弱。而转染ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ后的肾小逡逑管上皮细胞诱导产生大量ＲＯＳ，细胞ＲＯＳ生成比较阴性对照组明显增高（尸＜逡逑０．０５，图２、３）。证明ＳｍｇＧＤＳ低表达时对ＲＯＳ的诱导作用。为了判断ＲＯＳ逡逑的产生来源，细胞转染ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ后，我们加入ＮＡＤＰＨ氧化酶抑制剂逡逑Ａｐｏｃｙｎｉｎ邋５０ｐＭ、１（％Ｍ作用于肾小管上皮细胞。对比转染ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ组，逡逑Ａｐｏｃｙｎｉｎ降低了邋ＲＯＳ的生成（／？＜０．０５）。并且随着Ａｐｏｃｙｎｉｎ浓度的升高，ＲＯＳ逡逑生成逐渐减少，呈浓度依赖性（Ｐ＜０．０５）。结果如下图２所示。这说明ＳｍｇＧＤＳ逡逑低表达诱导产生的ＲＯＳ来源于ＮＡＤＰＨ氧化酶。结合Ｒａｃｌ在ＮＡＤＰＨ氧化酶逡逑家族所起的活化作用，出于验证Ｒａｃｌ是否参与其中的目的，我们进一步加入逡逑Ｒａｃｌ抑制剂ＮＳＣ２３７６６邋５０ｐＭ、１００ｐＭ预处理转染ｓｉＲＮＡ－ＳｍｇＧＤＳ的细胞。结逡逑果发现，ＮＳＣ２３７６６处理后的细胞ＲＯＳ的产生被抑制，且随着ＮＳＣ２３７６６浓度逡逑的升高，其减轻ＲＯＳ产生的能力增强，，呈浓度依赖性（Ｐ＜０．０５，图３）。该部逡逑分研究结果表明
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692

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本文编号：2595214