维生素D对狼疮肾炎患者血清IgG诱导足细胞损伤的保护作用的研究

发布时间：2020-03-26 12:12

【摘要】：背景:系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一种自身免疫性疾病,其特征在于产生自身抗体、免疫复合物并且在身体的不同部位沉积,导致多器官损伤。狼疮性肾炎(Lupus Nephritis,LN)是SLE最常见和最严重的并发症。在诊断为SLE的五年内,50%-70%的患者发生LN,并且可能导致永久性肾损伤和慢性肾脏病。在LN患者中,足细胞损害很常见,“单纯足细胞病”可能作为狼疮肾炎足细胞损害的一种形式。IV~V型LN患者的足突宽度(Foot Process Width,FPW)均较正常水平有显著改变,且FPW与蛋白尿水平相关(r=0.509,P0.001)。抑制足细胞损伤或将成为LN新的治疗靶点,对改善肾脏预后具有重大意义。自噬通过溶酶体降解细胞质内容物保持机体的内环境稳态。根据向溶酶体递送细胞质内容物的方式,科学家们已经鉴定出三种主要类型的自噬:巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。其中巨自噬是研究的最透彻的。巨自噬(以下称为自噬)描述了降解过程,形成独特的双膜囊泡(自噬体)以隔离细胞质的一部分,然后与溶酶体融合以形成自溶酶体并降解内部物质。近年来,关于维生素D的研究表明,它在疾病中发挥的作用不仅是传统的钙磷调节,在肿瘤、自身免疫病和肾脏疾病中,维生素D通过调节自噬活动的强度影响疾病的进展,例如肺小细胞肺癌、克罗恩病、慢性肾脏病和糖尿病肾病等疾病中均有报道。中国中部河南省SLE患者维生素D缺乏的患病率调查显示,维生素D不足的患病率高达97.52%,特别是34.71%的患者存在严重的维生素D缺乏症。Petri等人发现血清活性维生素D水平增加20ng/ml后,尿蛋白水平降低15%。既往有研究证明维生素D对足细胞损伤有保护作用。然而,维生素D是否通过自噬途径发挥对LN患者的足细胞保护作用尚未可知。本研究的目的是研究维生素D是否通过自噬途径在LN肾炎患者血清中纯化的自身抗体诱导的足细胞损伤中起保护作用。方法:本研究选取肾组织和永生化人类足细胞作为研究对象。1.人肾组织标本的收集:选取LN患者肾组织标本25例(III型n=5;IV型n=5;V型n=5;III+V型n=5;IV+V型n=5),肾肿瘤切除术后患者癌旁2cm以外的健康肾组织7例作为对照,标本取自郑州大学第一附属医院肾内科和泌尿外科。2.患者外周血血清组织的收集:收集确诊为狼疮肾炎的患者血清,离心后分离保存血清,以备提取血清中的自身抗体,标本均取自郑州大学第一附属医院。3.透射电镜(TEM)观察狼疮肾炎(LN)患者肾组织的自噬活动水平。透射电镜下观察狼疮肾炎(LN)患者(III型n=5;IV型n=5;V型n=5;III+V型n=5;IV+V型n=5)肾组织中足细胞、内皮细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞中自噬体的个数,计数并作统计学分析。4.对狼疮肾炎(LN)患者24小时尿蛋白、肾脏病理活动性评分与自噬体个数作相关分析。5.计数LN患者的自噬体个数并测量血清活性维生素D浓度,作相关分析。6.明确IgG对体外培养的人类足细胞的作用和对自噬程度的影响,并观察维生素D在损伤中的作用。纯化LN患者的血清中的IgG(1.5mg/ml)作用于体外培养的人类足细胞,加入维生素D(100nmol/L)观察自噬指标及足细胞相关指标的变化。在高倍透射电镜下观察足细胞,通过蛋白质印迹分析和实时定量荧光PCR评估自噬活性,在体外将mRFP-GFP-LC3B腺病毒转染到体外培养的人类足细胞中,在激光共聚焦显微镜下观察并计数黄色荧光的个数并作统计学分析。结果:1.在LN患者肾组织中观察到自噬水平显著升高(P0.05),在肾脏固有细胞中,足细胞显示出最高的自噬水平(P0.05)。在LN的不同分型中,V型(n=5)、III+V型(n=5)和IV+V型(n=5)的自噬水平高于III型(n=5)和IV型(n=5)。2.LN患者的自噬体个数与临床指标24小时尿蛋白呈正相关、与肾脏病理活动性评分呈负相关(P0.05)。3.血清维生素D浓度较高的的LN患者肾组织足细胞中自噬水平较低,且患者血清维生素D浓度与肾组织足细胞自噬体个数呈负相关(P0.01)。4.在体外培养的人类足细胞观察到狼疮性肾炎患者血清提取的IgG处理组较对照组的蛋白LC3B-II和Beclin 1的表达量升高、p62的消耗以及Nephrin表达量的减少,实时定量荧光PCR结果显示MAP1LC3B、BECN1基因表达的增多和SQSTM1基因表达的减少,在透射电镜下观察到更多的自噬体,并且在IgG组的共聚焦显微镜下观察到更多的自噬相关蛋白LC3B,这表明自噬的诱导和足细胞的损伤增加。与IgG组相比,在IgG+VD组中观察到自噬程度降低以及减轻的足细胞损伤。结论:1.狼疮性肾炎患者肾组织自噬程度较健康对照高,其中V型、III+V型、IV+V型足细胞显示出最高的自噬水平。2.狼疮性肾炎患者血清纯化的IgG能够导致体外培养的足细胞损伤及自噬水平升高,维生素D能降低自噬水平和缓解足细胞损伤。3.维生素D在LN患者自身抗体诱导的足细胞损伤中起保护作用,这可能是LN中的一种新型治疗靶点。
【图文】：

自噬体,足细胞,系膜细胞,肾小管上皮细胞

慢性化指数 0(0 4) 1(0 3) 0(0 0) 0(0 1) 1(1 2)自噬体个数足细胞 59.40±15.50 33.00±3.16 91.40±43.18 86.00±42.07 93.20±39.90系膜细胞 35.60±11.95 23.40±11.15 22.20±5.81 49.40±34.69 53.80±29.80内皮细胞 31.60±4.67 17.20±9.12 37.60±16.10 53.60±30.34 53.20±18.019肾小管上皮细胞 40.20±21.46 30.20±10.38 56.20±32.57 43.20±20.54 33.40±14.57

自噬体,狼疮肾炎,肾脏,足细胞

与健康对照（n = 7）相比，LN 患者同一个肾小球中的足细胞、系膜细胞、内皮细胞以及近端肾小管上皮细胞在一个铜网（约 7.065 平方毫米）区域内的自噬体数量不同，并且差异有统计学意义（P <0.05）（图 3.2-A）。与健康志愿者相比，LN 患者肾脏固有细胞的自噬活动水平更高，其中足细胞自噬程度的增高尤其明显。在不同类型的增殖型 LN 患者中，我们观察到足细胞中自噬体数量的显著差异（图 3.2-A, B）。V 型、III + V 型、IV + V 型表现出比其他类型更高的足细胞自噬水平（图 3.2-C，，P <0.05）。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.242

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