RacGAP1在前列腺癌恶性进展中的作用及机制研究
发布时间：2021-08-18 15:22
研究背景前列腺癌是一种严重影响人类生命健康的疾病,位居男性恶性肿瘤发病率第二位,同时,前列腺癌所导致的死亡病例数在所有肿瘤中排第五位。我国前列腺癌发病率较低,但近年来随着人口老龄化、肥胖、生活方式西方化和前列腺癌诊断技术的提高,我国前列腺癌患者数量呈高速增长趋势,年增长率达5%。雄激素受体(Androgen Receptor,AR)是前列腺发育和前列腺癌发生发展中的一个重要分子,它在与双氢睾酮等配体结合后,通过与雄激素依赖性基因启动子区域的雄激素反应元件结合,在转录共调节因子的辅助下,发挥转录调控作用。AR通过调控一系列下游基因的表达,促进前列腺癌细胞增殖、迁移、抗凋亡和上皮-间充质转化等功能。鉴于AR在前列腺癌发生发展中的关键作用,目前针对进展期前列腺癌,一线治疗方案是雄激素剥夺治疗(Androgen Deprivation Therapy,ADT)。在治疗初期,肿瘤细胞往往表现为对治疗较高的敏感性,但是,大多数前列腺癌经ADT治疗12-18个月后发生复发,并产生对雄激素剥夺的抵抗,转变为去势抵抗性前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer,CRPC),在大部分CRPC病例中均存在AR信号通路的重激活。因此,AR在前列腺癌进展和肿瘤复发中均发挥关键作用。通过对转移性前列腺癌的差异基因进行分析,我们发现了前列腺癌转移的一个差异基因,Rac GTP酶激活蛋白1(RacGAP1)。RacGAP1属于Rho小G蛋白家族,可以激活Rho蛋白的GTP酶水解活性,水解与之相连的GTP,使Rho蛋白失活。RacGAP1也是中心纺锤体的重要组成成分,控制胞质分裂收缩环的形成和其与细胞膜的锚定,在细胞分裂中发挥重要作用。此外,RacGAP1还参与STAT3激活和p-STAT3的入核,在其转录活性发挥中起关键调控作用,而STAT3可以在转录水平影响RacGAP1的表达;RacGAP1对HIF-1 α起负向调控作用,并通过HIF-1 α参与细胞缺氧调控。RacGAP1与畸形精子症、小鼠不育症、病毒感染等疾病有关。同时,RacGAP1的表达失调也与许多肿瘤相关。RacGAP1通过抑制Hippo/YAP信号通路,促进胞质分裂的发生,进而促进肿瘤细胞增殖;RacGAP1通过对Rho蛋白的调控促进肿瘤细胞转移;RacGAP1与STAT3的调控环路在肿瘤中也发挥重要作用,可以促进膀胱癌、肝癌等肿瘤进展。RacGAP1的高表达还与结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌和脑膜瘤等癌症的恶性程度、淋巴结转移、血管侵袭及不良预后相关。RacGAP1也在前列腺癌中存在表达失调,但其机制尚不明确。因此我们将关注点放在RacGAP1是否与前列腺癌的生物学行为有关,以及RacGAP1在前列腺癌进展过程中的作用和机制上,希望可以对这一严重危害人类健康的疾病有更深入的理解。研究目的1、寻找前列腺癌进展和转移中的差异表达基因;2、探究RacGAP1与前列腺癌进展的关系;3、探究RacGAP1与雄激素受体的关系;4、探究RacGAP1在前列腺癌中发挥作用的机制。研究方法一、寻找前列腺癌进展和转移中的差异基因1、使用多个GEO数据库,筛选转移性前列腺癌和原发性前列腺癌之间的差异基因,通过GO(Gene Ontology)功能分析,确定研究对象;2、使用TCGA、GEO数据库,探究RacGAP1与前列腺癌临床病理指标、患者预后的联系;3、使用我们的前列腺癌标本进行免疫组化实验,检测RacGAP1与前列腺癌指标的关系。二、RacGAP1在前列腺癌中的作用1、Western blot和RT-qPCR检测前列腺癌细胞系RacGAP1表达量;2、筛选RacGAP1 siRNA和过表达质粒,Western blot及RT-qPCR检测转染效率;3、使用MTS、EdU、Transwell和细胞划痕等实验,检测肿瘤细胞增殖、转移等能力。三、RacGAP1与雄激素受体的关系1、GEO数据库资料分析,探究去势/雄激素对RacGAP1表达的影响;2、使用LNCaP细胞检测RacGAP1是否具有雄激素反应性(剂量/时间);LNCaP细胞长时间剥夺雄激素培养,检测RacGAP1表达变化;3、干扰/过表达AR,检测RacGAP1表达变化;4、软件预测RACGAP1基因启动子区域有无雄激素反应元件(Androgen Responding Elements,ARE);5、ChIP实验探究AR是否可以直接结合到RacGAP1基因启动子上。四、RacGAP1在AR信号通路介导的前列腺癌进展中是否发挥作用通过拯救实验,检测RacGAP1在AR介导的前列腺癌细胞增殖中是否发挥作用。五、RacGAP1在前列腺癌中的作用机制1、Western blot检测RacGAP1对细胞周期蛋白的影响;2、DU145细胞瞬时干扰RacGAP1表达后,送表达谱芯片检测,差异表达基因;3、GSEA预测RacGAP1可能的下游基因:4、干扰/过表达RacGAP1后,检测相关基因及蛋白质表达变化。研究结果一、在转移性前列腺癌中,RacGAP1表达显著上调通过分析对比两个转移性前列腺癌的数据库,寻找转移性前列腺癌中表达上调的基因;细胞骨架和细胞周期相关分子在肿瘤细胞增殖和转移中发挥重要作用,因此,我们进行了 GO功能分析,寻找与细胞骨架和细胞周期相关的差异基因;在这些基因中,同时与细胞骨架和细胞周期有关的基因有35个,综合比较两个GEO数据集,RacGAP1是其中表达变化倍数较大的基因,因此选取RacGAP1作为本课题的研究对象。接下来,我们分析了 RacGAP1与前列腺癌临床病理指标的关系。在TCGA和GEO数据库资料中,我们分析发现,RacGAP1的高表达与较高的临床/病理T分期、Gleason评分、淋巴结及远处转移等密切相关;在我们的肿瘤样本中进行的免疫组化实验,也发现RacGAP1与较高的Gleason评分相关;RacGAP1高表达与前列腺癌生化复发密切相关。从以上实验结果中,我们得出结论,在前列腺癌进展过程中,RacGAP1表达显著上调。二、RacGAP1具有促进前列腺癌细胞增殖、迁移的能力在前列腺癌细胞系中,我们检测了RacGAP1的表达水平,结果显示,RacGAP1在VCaP、DU145细胞中高表达,在LNCaP细胞中表达较低;在细胞水平进行的功能实验中发现,RacGAP1在细胞水平发挥促进细胞增殖、迁移、克隆形成能力。以上结果证明了RacGAP1具有促进前列腺癌增殖转移的能力。三、RacGAP1是受AR调控的雄激素诱导性基因AR在前列腺癌的发生、发展和转移过程中均发挥重要作用,因此,接下来,我们对RacGAP1与AR的关系进行了探究。我们先使用GEO数据库数据(GSE22483和GSE8702)进行分析,结果显示,RacGAP1受雄激素和AR正向调控,剥夺雄激素后,RacGAP1表达呈先降低,后升高趋势;在我们的细胞实验中,也发现,在较长时间的雄激素剥夺过程中,RacGAP1表达呈现为先降低再升高;在细胞培养中加入雄激素,RacGAP1呈现出对雄激素在时间和剂量上的依赖性。在LNCaP细胞中干扰/过表达AR表达后,RacGAP1的mRNA和蛋白水平均随AR正向变化。AR是一种转录调控因子,因此我们猜测AR可以在转录水平,对RacGAP1发挥直接的调控作用。使用转录因子预测软件进行分析,结果显示,RacGAP1启动子区域有AR结合位点;使用ChIP实验对软件预测结果进行验证,结果证实,AR可以直接结合到RacGAP1的启动子上,发挥转录水平的调控作用。而RacGAP1可以作为分子伴侣,对一些核蛋白的入核和激活具有促进作用,因此我们猜测RacGAP1可能对AR入核和激活也具有促进作用。但CoIP实验证实,RacGAP1不能通过结合AR,对AR发挥分子伴侣功能;而RacGAP1对AR下游基因的表达也不具有调控作用。以上实验结果说明,RacGAP1是一个雄激素诱导性基因,可以被AR转录激活。四、RacGAP1在AR信号通路介导的前列腺癌细胞增殖中发挥作用在前一部分实验中,我们发现RacGAP1被AR转录激活,因此我们猜测,RacGAP1可能作为AR下游分子,在前列腺癌进展过程中发挥作用。在LNCaP细胞中干扰AR表达后,RacGAP1表达下调,同时细胞增殖能力降低,但当干扰AR,再过表达RacGAP1后,细胞增殖能力得到一定的逆转;而在过表达AR后,RacGAP1表达上调,细胞增殖能力增高,在此基础上,再干扰RacGAP1表达,可以导致细胞增殖能力的降低。从这一部分的实验中,我们得到结论,RacGAP1参与AR介导的前列腺癌进展过程。五、RacGAP1对下游分子的调控接下来,我们对RacGAP1在前列腺癌进展中的作用机制进行了探究。在DU145细胞中干扰RacGAP1表达后,送基因组表达谱芯片分析。对表达谱芯片结果进行基因集富集性分析(GSEA),发现差异表达基因主要富集在BMI1、MYC、mTOR和E2F等与肿瘤相关的通路;接下来,我们对GSEA分析结果进行Western blot和RT-qPCR实验验证,结果显示,RacGAP1可以在蛋白水平正向调控C-MYC表达,RacGAP1可以上调c-Myc下游基因表达。我们检测了细胞周期蛋白的表达,结果显示,RacGAP1可以调控细胞周期蛋白的表达。研究结论1、在转移性前列腺癌中,RacGAP1表达水平显著升高;2、RacGAP1在前列腺癌中的高表达与较高的临床分期、高Gleason评分、转移、和生化复发有关;3、RacGAP1是受AR转录调控的雄激素诱导性基因;4、RacGAP1作为AR下游分子,在前列腺癌细胞增殖、转移中发挥重要作用;5、RacGAP1可能通过调控细胞周期以及c-Myc等重要致癌分子活性,发挥促癌作用。【学位级别】：硕士
【图文】：
ＡＲ对前列腺的正常发育至关重要。它通过调控包括成纤维细胞生长因子逡逑（ＦＧＦ）、角化细胞生长因子、胰岛素样生长因子（ＩＧＦ）及血管内皮生长因子在逡逑内众多生长因子的表达，促进前列腺上皮细胞生长和正常分化＾２：。ＡＲ在前列腺逡逑癌的进展中也发挥重要作用。ＡＲ可以发挥抗凋亡功能，有研究显示，ＡＲ通路的逡逑激活可以上调Ｆ０Ｘ０３ａ和ＦＬＩＰ蛋白的表达，这两种蛋白是重要的抗凋亡因子％邋；逡逑而干扰ＡＲ表达，可以诱导前列腺癌细胞的凋亡［２４：。ＡＲ与ＴＧＦＰ协同作用，对下逡逑游转录因子Ｒｕｎｘ２进行调控，促进前列腺癌细胞的增殖；ＡＲ还可以通过激活Ｓｍａｄ３、逡逑Ｓｍａｄ４和ＩＬ－６等分子，发挥促进肿瘤细胞增殖的功能［２Ｍ８；。除此之外，ＡＲ也发逡逑挥促进前列腺癌转移的作用，ＡＲ通过上调ＭＭＰ－２蛋白质表达水平和ＥＲＭ蛋白的逡逑磷酸化水平，促进肿瘤细胞迁移和浸润ｒａ：。ＡＲ还通过与细胞骨架蛋．白细丝蛋逡逑白Ａ组成复合体，发挥招募整联蛋白Ｐ邋１以及控制黏着斑激酶、|У鞍缀停遥幔愕板义习妆泶锏淖饔茫佣俳琢鱿赴疲郏浚ⅲ骸Ｉ掀ぃ涑渲首ā福蓿备迹叮保矗保义希恚澹螅澹睿悖瑁恚幔戾澹簦颍幔睿螅椋簦椋铮睿牛停裕┦嵌裥灾琢鲎频闹匾蹋醒芯肯允荆粒义义稀，
本文编号：2616121
【图文】：
ＡＲ对前列腺的正常发育至关重要。它通过调控包括成纤维细胞生长因子逡逑（ＦＧＦ）、角化细胞生长因子、胰岛素样生长因子（ＩＧＦ）及血管内皮生长因子在逡逑内众多生长因子的表达，促进前列腺上皮细胞生长和正常分化＾２：。ＡＲ在前列腺逡逑癌的进展中也发挥重要作用。ＡＲ可以发挥抗凋亡功能，有研究显示，ＡＲ通路的逡逑激活可以上调Ｆ０Ｘ０３ａ和ＦＬＩＰ蛋白的表达，这两种蛋白是重要的抗凋亡因子％邋；逡逑而干扰ＡＲ表达，可以诱导前列腺癌细胞的凋亡［２４：。ＡＲ与ＴＧＦＰ协同作用，对下逡逑游转录因子Ｒｕｎｘ２进行调控，促进前列腺癌细胞的增殖；ＡＲ还可以通过激活Ｓｍａｄ３、逡逑Ｓｍａｄ４和ＩＬ－６等分子，发挥促进肿瘤细胞增殖的功能［２Ｍ８；。除此之外，ＡＲ也发逡逑挥促进前列腺癌转移的作用，ＡＲ通过上调ＭＭＰ－２蛋白质表达水平和ＥＲＭ蛋白的逡逑磷酸化水平，促进肿瘤细胞迁移和浸润ｒａ：。ＡＲ还通过与细胞骨架蛋．白细丝蛋逡逑白Ａ组成复合体，发挥招募整联蛋白Ｐ邋１以及控制黏着斑激酶、|У鞍缀停遥幔愕板义习妆泶锏淖饔茫佣俳琢鱿赴疲郏浚ⅲ骸Ｉ掀ぃ涑渲首ā福蓿备迹叮保矗保义希恚澹螅澹睿悖瑁恚幔戾澹簦颍幔睿螅椋簦椋铮睿牛停裕┦嵌裥灾琢鲎频闹匾蹋醒芯肯允荆粒义义稀，
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