基质γ-羧基谷氨酸蛋白MGP表达及活性改变对肾结石形成的影响

发布时间：2020-04-13 09:30

【摘要】：肾结石是一种由环境饮食因素和遗传因素引起的复杂疾病,以肾小管或肾间质的晶体异常沉积为特征,临床常表现为肾脏功能受损和尿路阻塞,发病率超过6-12%,五年再发率达50%,并可终生多次再发。肾结石的形成机制复杂,至今对其分子形成机制仍不清楚,导致目前临床缺乏有效的治疗和预防措施,而多以碎石、手术等方式暂时缓解病症,不能在肾脏钙化的发病机制上对结石形成进行有效的药物抑制和再发预防。肾脏在维持和调节人体水、盐均衡,排除代谢废物的同时,易在肾小管形成盐的过饱和状态,在常见的代谢异常如高草酸尿、高钙尿的风险环境下,结晶沉积在肾小管或肾间质,导致肾脏钙化,结晶不断成核、聚集和生长,最终形成肾结石。在这个过程中,肾脏通过主动或被动的生物学行为表达和分泌一些大分子蛋白参与和影响结石形成。基质谷氨酸蛋白(Matrix Gla protein,MGP)是一种维生素K依赖性的分泌蛋白,研究表明MGP与血管钙化有关,是血管钙化的抑制剂。我们研究组先前研究发现,高草酸大鼠肾脏中在MGP蛋白表达的部位没有结晶出现,提示MGP可能也与肾结石的发病或病理过程相关,但具体分子机制不明。本研究拟分别在细胞和动物水平,通过调控MGP基因的表达量或者改变MGP蛋白的活性来阐明MGP蛋白对草酸钙结石形成及其对细胞损伤的影响,以探索MGP在肾结石形成中的具体作用机制。首先,我们研究了MGP基因表达改变在草酸钙结晶诱导肾小管上皮细胞损伤中的影响,我们构建了表达靶向MGP基因的小干扰RNA序列的重组腺病毒(Ad-siMGP),以及过表达MGP基因的重组腺病毒(Ad-MGP)。我们用这两种腺病毒分别感染肾小管上皮HK-2细胞,同时分别设定对照组,以研究改变细胞内MGP基因的表达对草酸钙结晶形成的影响。实时荧光定量PCR实验的结果表明,Ad-MGP和Ad-siMGP分别转染HK-2细胞48 h后,显著升高或者降低了MGP mRNA的水平。我们初步实验的原子吸收光谱检测结果表明,Ad-MGP所诱导的MGP基因高表达显著降低了草酸钙结晶与HK-2细胞之间的黏着力。暗示MGP基因的上调可以通过减弱细胞黏着力从而减轻结晶对细胞的黏着而发挥肾小管上皮细胞的保护作用。其次,我们利用草酸钙结晶刺激HK-2,研究了MGP蛋白的活性变化对结晶形成及对HK-2细胞损伤和凋亡的影响。有研究证实,维生素K1能显著提升MGP蛋白活性,华法令则可以通过抑制维生素K1的合成发挥抑制MGP活性的作用,因此本研究中分别利用维生素K1和华法令上调或者下调MGP蛋白的活性,以草酸钙结晶联合维生素K1及华法令刺激HK-2,分别用MTT法及DAPI染色法检测MGP蛋白活性变化对细胞损伤及凋亡的影响。结果表明,在草酸钙结晶诱导了HK-2细胞损伤及凋亡的情况下,华法令的使用加重了结晶对细胞损伤及凋亡作用,而维生素K1与华法令的联合添加则缓和了华法令的作用。这一结果暗示,MGP在草酸钙结晶诱导的细胞损伤及凋亡中发挥细胞保护作用。我们进一步利用原子吸收光谱法检测草酸钙结晶对细胞黏着的影响,结果表明维生素K1添加的细胞显示出显著的细胞黏着力的下降,暗示MGP蛋白的活化可以通过减弱细胞黏着力从而减轻结晶对细胞的黏着而发挥肾小管上皮细胞的保护作用。而Ad-siMGP诱导的MGP基因的下调逆转了维生素K1对结晶所致HK-2细胞引起的细胞粘着力的下降。这一结果证明维生素K1对肾小管上皮细胞抵抗草酸钙结晶的保护作用是通过增强MGP的活性实现的。最后,我们研究了动物水平上MGP参与肾结晶形成过程的可能影响。实验所用的大鼠随机分为三组,分别为空白对照组(-)、模型对照组(Normal saline组,注射生理盐水的草酸钙肾结石模型对照组)以及维生素K1组(Vitamin K1组,注射维生素K1的草酸钙肾结石模型组)。免疫组织化学联合偏光显微镜观察结果显示,与空白对照组相比,模型对照组大鼠肾脏出现明显的结晶,证明乙二醇导致肾结石模型造模成功。与模型对照组相比,维生素K1组大鼠肾脏组织的结晶明显变小,且数量显著减少,证明维生素K1的添加减轻了草酸钙结晶的形成。这一结果也提示,维生素K1的补充可以成为临床防治肾结石形成的新思路。综上所述,本实验在细胞和动物水平通过改变MGP基因表达量及MGP蛋白活性初步研究了MGP蛋白对草酸钙结石形成的影响,证明了MGP基因表达量的上调和MGP蛋白活性的增强可以使HK-2细胞与草酸钙结晶之间的黏着力显著下降;同时,改变MGP蛋白活性可以改变结晶导致肾小管上皮细胞的损伤及凋亡作用;维生素K1显著降低了大鼠肾脏草酸钙结晶的形成。这些结果证明,MGP蛋白可以通过降低结晶与细胞黏着发挥抑制肾结石形成和保护肾上皮细胞免于损伤的作用。我们的结果丰富了肾结石形成的理论,为深入研究肾结石形成的分子机制奠定了坚实的基础,并且为临床肾结石的防治策略提供了新的思路。
【图文】：

γ-羧基谷氨酸,相关疾病,基质,蛋白

引言的应用从侧面证实了维生素 K 在血管钙化中的作用。1998 年 Price 实验室研究了华法令对软组织钙化的影响：香豆素衍生物是大鼠毒素的主要成分导致大鼠出血死亡，为了防止这一点，同时向大鼠施用华法令和维生素 K样可以施用高剂量的华法林以防止软组织中的 γ-羧化影响凝血。他们发现令能引起主动脉弹性薄片的快速钙化，类似于 MGP 缺陷小鼠的表型[50]。素 K 首次以钙化抑制剂身份与 MGP 联系到一起[50]。不同于 Price 对大鼠超生理剂量的华法令，McCabe 等人检测了治疗剂量的华法令对未患有肾大鼠的影响：组织中有维生素 K 缺陷，但华法令并没有诱导健康大鼠血管化，相比之下，，华法令在慢性肾脏病存在时会显著增加血管钙化水平[51]。综上所述，维生素 K 和华法令在进行 MGP 参与血管钙化的研究中被做GP 的激动剂和抑制剂而广为使用。

序列,穿梭载体,腺病毒,图谱

第 1 章 MGP 基因表达改变对肾结石形成的影响商品化腺病毒 MGP 干扰载体（Ad-siMGP）和驱动 MGP 过表达的重组腺病毒过表达载体（Ad-MGP）, 均购自上海和元生物。其中 Ad-siMGP 的构建中，设计针对人 MGP 的 shRNA 干扰双链 DNA 片段，通过分子生物学手段将该干扰片段及绿色荧光蛋白 EGFP 基因重组，并插入到腺病毒穿梭载体（pDKD-CMV-eGFP-U6-shRNA）的 U6 启动子下游，该载体在干扰 MGP 基因的同时可以表达绿色荧光蛋白 EGFP 基因。对于驱动 MGP 过表达的 Ad-MGP构建，在穿梭载体构建的设计时 MGP cDNA 的下游也有 EGFP 融合蛋白序列。重组腺病毒中 EGFP 蛋白的表达便于后续感染的追踪和最适感染复数的确定。
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692.4

【参考文献】