蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1在肾脏缺血再灌注损伤中的作用与机制研究

发布时间：2020-04-15 18:52

【摘要】：肾脏缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury)是肾移植过程中不可避免的病理生理现象,贯穿于器官获取、器官运输、移植手术以及术后恢复全过程。肾脏缺血再灌注损伤是肾脏中多种细胞共同参与的一类无菌性炎症反应,以肾小管上皮细胞损伤修复或凋亡坏死为显著性特征,临床上可表现为移植肾功能延迟恢复或急慢性排斥。肾小管上皮细胞对缺血缺氧环境较为敏感,且又是肾脏结构组成中的主要细胞单位。研究其在缺血再灌注损伤中损伤和修复过程,以及此过程中关键基因的表达调控和机制,将有可能是解决肾脏缺血再灌注损伤的有效途径。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1属于酪氨酸磷酸酶家族中的重要成员,主要负责负向调控造血细胞的酪氨酸磷酸化信号通路。磷酸化和去磷酸化反应是机体对外界环境刺激的重要表现形式和维持自身稳态的必要方式。当机体受到环境刺激压力时,激酶发生级联激活,抗压基因表达上调来应对环境压力;磷酸酶则使底物磷酸根基团发生水解反应以去除,使之回到静息状态,最终使得机体维持稳态。SHP-1的功能首次在SHP-1基因缺陷小鼠的异常表型中得到阐释,即SHP-1缺失后表现为炎症过度激活不受控制,最终小鼠死于自身免疫反应。随后SHP-1被证明与多种免疫细胞的功能状态均有关,调控多种类型的免疫细胞信号传导。然而,SHP-1在非造血细胞中的作用尚不明确。为了探究SHP-1在肾脏缺血再灌注损伤中的作用与机制研究,本研究使用SHP-1基因突变缺失型小鼠,构建肾脏缺血再灌注损伤模型。对比同窝野生型小鼠,我们发现SHP-1缺失后,肾小管上皮细胞凋亡和坏死显著增多。这提示SHP-1的作用机制可能与凋亡信号通路相关,且有可能是一种保护作用。在进一步检测其他凋亡指标后,更加明确了SHP-1缺失使得小鼠面临更为严重的肾脏缺血再灌注损伤,即确认了SHP-1可能通过调控凋亡信号通路,对肾脏缺血再灌注损伤起到保护作用。然而,SHP-1具体是作用于何种细胞而发挥功能尚未可知。SHP-1既有可能是抑制巨噬细胞为代表的免疫细胞的活化,降低炎症反应从而减轻缺血再灌注损伤;也有可能是直接作用于肾实质细胞,如肾小管上皮细胞,抑制其凋亡信号通路的激活。据此,我们设计了巨噬细胞清除实验来评估巨噬细胞在其中发挥的功能。通过对野生型和SHP-1缺陷小鼠注射氯膦酸二钠脂质体(clodronate liposome)和对照试剂(PBS liposome),我们发现清除巨噬细胞后,肾损伤都有所减轻,即明确了巨噬细胞在肾缺血再灌注损伤中的促进炎症发生发展的作用。但通过进一步深入比较清除巨噬细胞带来的保护作用,发现这种保护作用在两种基因型小鼠中相当,即清除巨噬细胞带来的保护作用与是否缺失SHP-1表达无关。与此同时,我们将小鼠肾脏缺血再灌注损伤后的组织进行连续切片和免疫组化染色。发现SHP-1表达阳性的细胞与AQP-1(肾小管上皮细胞特征性表达的蛋白)表达阳性的细胞位置一致,而与F4/80(巨噬细胞特征性表达的蛋白)表达阳性的细胞位置不同,因此我们更加确信地将SHP-1发挥功能的细胞单位聚焦于肾小管上皮细胞中。为了揭示SHP-1在肾小管上皮细胞中如何发挥抗凋亡的作用,我们继续构建了体外细胞模型,以求探索SHP-1作用的机制。根据文献中的方法,我们使用CoCl_2来模拟细胞缺氧损伤,进而刺激肾小管上皮细胞(TCMK1)诱发凋亡。经过时间和浓度的摸索,我们发现TCMK1受CoCl_2刺激产生的凋亡效应是受时间和浓度依赖的。使用合适的浓度(200μmol/L)和时间(24 h)刺激TCMK1,相比于对照组,CoCl_2刺激后细胞凋亡水平和凋亡相关分子表达水平皆上调,这些结果明确了细胞模型的有效性和稳定性。为了验证SHP-1在细胞模型中的抗凋亡特性,我们构建出了SHP-1过表达质粒,并且包装成慢病毒感染正常培养的TCMK1细胞。经过后续的嘌呤霉素筛选和表达验证,我们拿到了具有稳定过表达SHP-1能力的TCMK1单克隆细胞株(简称TCMK1OV)。我们立即开展了TCMK1 OV功能实验,即使用CoCl_2以同样刺激浓度和刺激时间分别刺激TCMK1 OV和感染空载对照病毒的细胞,评估凋亡水平。结果表明,与对照组的细胞相比,TCMK1 OV凋亡发生率显著降低。为了全面评估凋亡水平,我们使用流式染色方案、免疫荧光染色以及免疫印迹等实验方法,这些结果均一致性地表明,过表达SHP-1显著降低肾小管上皮细胞应对缺氧所诱导的凋亡损伤。为全面论证SHP-1在肾小管上皮细胞中的抗凋亡作用,我们补充了将SHP-1基因从肾小管上皮细胞中敲除或敲低之后的功能实验。我们发现SHP-1表达下调后,应对CoCl_2刺激凋亡显著增多,与体内动物实验结果也相吻合。据此,我们得出结论,SHP-1通过抑制凋亡的方式保护了肾小管上皮细胞应对缺血再灌注损伤。上述的细胞功能实验与动物实验结果相呼应,一致性地表明SHP-1抗凋亡的保护作用。并且我们在动物和细胞中检测了凋亡的启动开关——caspase 3的剪切活化,结果均表明SHP-1抗凋亡效应是通过调节caspase 3的剪切活化来实现。但SHP-1如何更具体地调节caspase 3的剪切活化,目前尚未知晓。导致这一状况的原因之一就是SHP-1在肾小管上皮细胞中发挥功能的亚细胞定位目前不明。它既有可能在胞浆中行使常规的磷酸酶功能,也有可能如少数文献所述的入核发挥作用。为了辅助判断,我们使用细胞免疫荧光染色实验予以确定。实验结果表明SHP-1是作为肾小管上皮细胞中的胞浆分子发挥磷酸酶的作用,这一结论也为下一步的作用机制探讨提供了方向。为了能明确SHP-1在胞浆中的作用靶点,我们筛选了凋亡信号通路中潜在的SHP-1作用底物。Caspase 3的活化剪切是凋亡信号通路最终活化的重要标志,在筛选SHP-1可能作用的靶点时,我们也将能调控caspase 3剪切活化的分子作为筛选标准之一。MAPK信号通路分子广泛参与细胞增殖、分化、炎症和凋亡等过程,且有文献报道其参与活化caspase 3的信号网络。MAPK是经典的三次级联信号激活模式,即MAPKKK/MAPKK/MAPK。其中,MAPK中与凋亡存在明确调控关系的是JNK。ASK1属于MAPKKK家族的一员,同时是JNK的上游调控分子。我们通过文献,发现了ASK1分子与SHP-1之间存在联系。我们检测了不同表达状态下的SHP-1所对应的ASK1的表达量,我们发现在mRNA或蛋白水平上SHP-1的表达与ASK1的表达无关联性。在排除SHP-1在表达上对ASK1的调控作用,并结合SHP-1酪氨酸磷酸酶的功能进行推测,结果表明SHP-1过表达后可以显著抑制ASK1的酪氨酸磷酸化水平,即SHP-1调控的ASK1翻译后的修饰。进一步地,通过免疫共沉淀实验,我们确认了SHP-1可以与ASK1相互作用的关系。为了更加明确SHP-1和ASK1相互作用的结构域,我们分别根据各自蛋白结构构建了不同的截短体,并通过免疫共沉淀实验发现SHP-1的羧基端磷酸酶结构域是结合ASK1的必要条件,而ASK1的中段的激酶结构域是结合SHP-1的必要条件。最后,我们回归到信号通路分子的验证环节,我们发现SHP-1敲除的稳转细胞株与空载对照细胞株相比,经CoCl_2刺激后ASK1的下游JNK磷酸化程度也增高。即SHP-1直接抑制ASK1的磷酸化,从而间接抑制了JNK的活化和后续的caspase 3的剪切活化,最终减轻凋亡反应。综上所述,本研究系统地探索了SHP-1在造血细胞之外,以肾小管上皮为代表的非造血细胞中的重要功能。我们明确了SHP-1在肾I/R损伤中的的抗凋亡作用和其作用机制,指出了SHP-1作用的靶分子——ASK1,同样存在酪氨酸磷酸化的修饰方式,为将来研发药物有效治疗肾缺血再灌注损伤提供了理论支撑。
【图文】：

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图 1-1 同源重组的原理（引自一步法克隆试剂盒说明书）设计好引物后，注意使用高保真 DNA 聚合酶，以防止在 DNA 扩增阶段所引突变。b. 短片段 DNA 分子短片段通常是用于 RNA 干扰和 CRISPR/Cas9 敲除质粒的构建。短片段的来源是单链的引物退火形成互补的双链结构。所以在设计好打靶序列后，两端加上酶的黏性末端结构，另一条互补链引物的设计就按照中间核心的打靶序列互补，两按照黏性末端切口对应的碱基。RNA 干扰质粒构建引物设计如下图：

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-1 同源重组的原理（引自一步法克隆试剂注意使用高保真 DNA 聚合酶，以防止在A 分子于 RNA 干扰和 CRISPR/Cas9 敲除质粒的形成互补的双链结构。所以在设计好打靶另一条互补链引物的设计就按照中间核心对应的碱基。RNA 干扰质粒构建引物设计
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692

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