自噬抑制剂对去势抵抗性前列腺癌抗癌治疗的影响研究

发布时间：2020-04-18 07:11

【摘要】：目的:探讨自噬抑制剂HCQ联合化疗药物DOC对去势抵抗性前列腺癌22RV1细胞株体内外的增殖影响,及其自噬基因Bcelin-1、自噬特异性底物P62、促凋亡基因Bax mRNA的表达变化与自噬蛋白Bcelin-1、自噬特异性标记物LC3B蛋白、促凋亡蛋白Bax的表达影响,以进一步了解CRPC患者对化疗药物产生抵抗的生物学机制,为临床通过自噬水平的调节来治疗CRPC提供一定的研究基础,也为CRPC患者的耐药监测提供检测靶点。方法:体外培养去势抵抗性前列腺癌22RV1细胞株,体内建立去势抵抗性前列腺癌22RV1细胞株裸鼠移植瘤动物模型,分别设置空白对照组和DOC、HCQ+DOC两个实验组,其中体外DOC和HCQ+DOC实验组下分别设置DOC为10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)mol/L三个浓度组。HCQ+DOC实验组采用自噬抑制剂HCQ进行自噬干预后再行DOC给药。分别观察细胞增殖活性的改变及体内移植瘤生长体积的变化,同时应用qPCR技术检测22RV1细胞株和移植瘤中Beclin-1、P62、Bax mRNA以及Western blot技术检测Beclin-1、LC3B、Bax蛋白质的表达水平。结果:1.体外细胞增殖变化:DOC和HCQ+DOC各实验组与空白对照组比较,细胞的增殖程度均出现下降,差异有统计学意义(P0.05);在DOC和HCQ+DOC实验组中,细胞的增殖活性均随着DOC浓度的增加而减弱,两两比较的差异有统计学意义(P0.05);在同一DOC浓度下,HCQ+DOC组细胞的增殖程度均较DOC组更低,差异有统计学意义(P0.05)。其中DOC浓度为10~(-7)mol/L时,差异最为显著。DOC+HCQ联合用药时药物DOC的IC50也由单独作用时的10~(-6.120)mol/L下降为10~(-7.536)mol/L。2.体内移植瘤生长体积变化:DOC和HCQ+DOC各实验组与空白对照组相比较,随着周次增加,移植瘤增长体积出现逐渐降低的趋势,差异有统计学意义(P0.05);在DOC和HCQ+DOC两个实验组间比较,HCQ+DOC组移植瘤周体积增长值均不同程度低于DOC组,到第四周HCQ+DOC组的周体积增长值较DOC组出现了明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。3.mRNA检测结果:(1)体外培养细胞株mRNA检测:与空白对照组相比较,DOC组和HCQ+DOC组基因Beclin-1、P62、Bax mRNA的表达量均都有所上升;与DOC组相比较,HCQ+DOC组的基因Beclin-1、P62、Bax mRNA的表达量更高,差异有统计学意义(P0.05)。(2)体内移植瘤细胞mRNA检测:与空白对照组相比较,DOC组的基因Beclin-1、Bax以及HCQ+DOC组的基因Beclin-1、P62、Bax mRNA的表达量都有所上升;与DOC组相比较,HCQ+DOC组的基因Beclin-1、P62、Bax mRNA的表达量更高,差异有统计学意义(P0.05)。4.蛋白质检测结果:(1)体外培养细胞株各蛋白检测:相对于空白对照组,实验组DOC和HCQ+DOC的自噬蛋白Beclin-1、自噬特异性标记物LC3B蛋白、促凋亡蛋白Bax都出现高表达,且HCQ+DOC组的表达更高,差异有统计学意义(P0.05)。(2)体内移植瘤细胞各蛋白检测:相对于空白对照组,实验组DOC和HCQ+DOC的自噬特异性标记物LC3B蛋白、促凋亡蛋白Bax表达均出现上调,且HCQ+DOC组的表达更高,差异有统计学意义(P0.05);HCQ+DOC组自噬蛋白Beclin-1的表达则明显高于空白对照组与DOC组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:本实验结果表明在体内外使用自噬抑制剂HCQ对去势抵抗性前列腺22RV1细胞株进行自噬干预,可明显抑制前列腺癌细胞的增殖,同时能明显增强Beclin-1、P62、Bax mRNA的表达及Beclin-1、LC3B、Bax蛋白的表达,从而调节自噬表达的下调过程。由此我们认为自噬抑制剂HCQ可增强前列腺癌22RV1细胞株对化疗药物DOC的敏感性。
【图文】：

给药结束后第三天采用颈椎脱臼法处死裸鼠，采用剪刀、镊子等工具，迅速剥离出瘤体，分成 4-5 小块儿，用锡箔纸包裹起来，做好标记，置于盛有干冰的盒子里面，待所有裸鼠取材完毕后，将肿瘤块儿转移至液氮中保存，以供后续mRNA 和蛋白质的检测。3 统计分析方法采用统计软件 SPSS 21.0 对数据进行统计分析，Graphpad Prism 6.0 进行作图，计量数据均用（ X ± SD)来表示，对数据进行正态性检验，根据数据类型选择方差分析或非参数分析比较组间差异，，以 P＜0.05 表示有统计学意义。4 实验结果4.1 体外细胞实验结果4.1.1 药物作用的细胞增殖状态

各小组细胞被相应药物作用 72h 后的增殖程度见图 1：与空白对照组比较，DOC 组和 HCQ+DOC 组中细胞的增殖都有所减弱，细胞死亡增多，细胞碎片增多，状态更差；在 DOC 和 HCQ+DOC 实验组下，各小组细胞的增殖活跃度随着化疗药物 DOC 浓度的增加逐渐降低，细胞死亡增多；在同一 DOC 浓度下，HCQ+DOC 组细胞的增殖能力较 DOC 组均出现下降，细胞死亡增多。4.1.2 CCK-8 法药物敏感实验结果及统计学处理各实验组吸光度检测结果见表 2，根据各组吸光度值作图见图 2。表 2 各实验组细胞 CCK-8 结果（ X ± SD)空白对照 DOC6 DOC7 DOC8 HCQ+DOC6 HCQ+DOC7 H值 0.9800±0.0075 0.4797±0.0092 0.5710±0.0080 0.6048±0.0087 0.3650±0.0083 0.4410±0.0094 0.5
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.25

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 高灵素;虞国慧;;自噬对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响[J];安徽医药;2015年04期

2 唐礼功;谢森;潘铁军;李志雄;陈欢欢;井莹;;低氧通过诱导自噬增强小鼠前列腺癌细胞的化疗抵抗作用[J];华中科技大学学报(医学版);2013年06期

相关硕士学位论文 前2条

1 姬凌;细胞自噬调节造血干细胞静息机制的初步探讨[D];第三军医大学;2015年

2 江凤;自噬在骨髓增生异常综合征疾病演进过程中的作用研究[D];苏州大学;2015年

本文编号：2631852