免疫关卡点分子B7-H1对膀胱癌糖代谢的作用机制研究

发布时间：2020-04-19 03:42

【摘要】：目的:膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,也是全身十大常见肿瘤之一,并且在我国泌尿生殖系肿瘤发病率中排第一位。而近年来对膀胱癌的研究发现,膀胱癌细胞表面高表达的程序性死亡配体1(B7-H1,也称PD-L1)在其发生发展过程中发挥至关重要的作用,因此针对B7-H1/PD-1途径的研究也日益深入,并且针对该途径的免疫靶向治疗取得了明确的临床疗效;但是,接受这种治疗的患者中仍有相当一部分存在疗效欠佳甚至无效的情况,导致不能通过该治疗有效的治疗膀胱癌,所以研究这些治疗无效的膀胱癌患者机体中,发生了何种改变,将会为膀胱癌的治疗提供新的突破点。而已知肿瘤细胞的生命活动离不开能量的代谢,作为对其生存有极其重要作用的免疫逃逸更是离不开糖代谢的能量的供给,并且肿瘤细胞采取有氧糖酵解的方式供能已为大家所公认,所以本研究通过阻断程序性死亡配体1(B7-H1)的表达,探究膀胱癌糖代谢的改变,初步揭示膀胱癌细胞免疫逃逸的发生与肿瘤糖代谢之间的关系,并为那些接受B7-H1/PD-1途径的免疫治疗无效的患者,提供治疗膀胱癌的新思路。方法:将培养的膀胱癌细胞(T24细胞)分为实验组及对照组两组,分别使用B7-H1的阻断剂(MIH1型阻断剂)和其溶剂PBS处理,各处理24h后,进行下列实验。首先将荧光标记2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)作为光学探针培养两组细胞,检测培养0.5h后膀胱癌细胞的荧光强度,来判断膀胱癌细胞经B7-H1阻断后,摄取葡萄糖能力的改变情况;然后,将相同培养条件下(除B7-H1阻断外无其他不同)两组细胞的培养液经过24h培养后提取出来,用乳酸试剂盒测量糖酵解代谢产物乳酸的含量,以显示膀胱癌细胞阻断后糖酵解能力的差别;最后,将两组细胞分别提取蛋白,并通过Western blot检测糖酵解关键酶(HK-2、PKM-2、LDHA)以及相关信号通路(pten/pi3k/akt/m TOR)通路中Akt和活化的p Akt表达情况,反映具体影响糖酵解的信号机制。结果:(1)经B7-H1阻断剂阻断24h后,使用流式细胞仪检测膀胱癌细胞表面B7-H1的表达量,对照组的为9.179±0.1255,而B7-H1阻断组B7-H1的表达量为0.3957±0.02976,P0.05,差异有统计学意义,说明阻断B7-H1后实验组表达量极少;(2)B7-H1阻断组的膀胱癌细胞与对照组膀胱癌细胞中2-NBDG的荧光强度相比,B7-H1阻断组的荧光强度OD值为393.9±1.803,而对照组的为469.7±4.017,可以看出阻断组荧光强度显著下降,表明膀胱癌细胞的葡萄糖摄取能力下降;(3)B7-H1阻断组癌细胞中的乳酸含量为0.8254±0.01993mmol/L,而对照组中的乳酸含量为1.227±0.01202 mmol/L,阻断组与对照组相比,代谢产生的乳酸含量明显下降,反映出阻断B7H1后,膀胱癌细胞有氧糖酵解能力降低;(4)B7-H1阻断组癌细胞中,糖酵解关键酶HK下降40.01%,LDHA下降49.56%,PKM-2下降35.82%,且均有统计学意义(p0.05);介导糖酵解途径信号通路蛋白AKT下降44.34%,其活性形式p-AKT下降44.68%,且均有统计学意义(p0.05),表明B7-H1是通过降低HK-2、PKM-2、LDHA等糖酵解关键酶以及pten/pi3k/akt/m TOR蛋白合成降低,对膀胱癌细胞糖酵解途径进行阻断的。结论:通过对膀胱癌细胞(T24细胞)中2-NBDG的荧光强度检测,我们发现经B7-H1阻断可以使膀胱癌细胞的摄取糖能力下降;并且通过对代谢产物乳酸,代谢关键酶HK-2、PKM-2、LDHA,以及信号通路中Akt、p Akt的分析,进而我们得到初步结论,B7-H1通过阻断代谢酶和信号通路中蛋白的合成,使得膀胱癌细胞糖酵解能力下降,此途径可为治疗膀胱癌提供新思路。
【图文】：

青岛大学硕士学位论文3 实验结果1 经 MIH1 阻断 B7H1 后，B7H1 表达量降低为了阻断膀胱癌细胞（T24 细胞）的糖代谢过程，我们在培养的膀胱癌细胞入 B7H1 阻断型抗体 MIH1 进行 B7H1 的表达阻断来实验这一实验目的。MIH1 和试剂处理 T24 细胞 24h 时间后，通过与单克隆抗体 B7-H1-PE 荧光抗体结合，式细胞仪测得荧光强度值，通过荧光强度来反应 B7H1 的表达量变化。对照组膀细胞组的 B7H1 的表达量为 9.179 ± 0.1255（Mean±SD，图 1B），而 B7H1 阻断H1 的表达量为 0.3957 ± 0.02976（Mean±SD，图 1A），两组之间有显著差异（对 t 检验，P<0.0001, N=3），说明 MIH1 处理，对 T24 细胞中 B7H1 的表达存在的阻断作用。结果如下图 1 所示。

图 3 T24 细胞经 MIH1 抗体阻断 B7H1 表达的乳酸含量为 1.227 ± 0.01202 mmol/L，而下降到 0.8254 ± 0.01993 mmol/（配对 t 检验3.4 B7H1 阻断使 T24 细胞中糖酵解关键酶平下降膀胱癌 T24 细胞中，存在多种糖酵解关键酶致使其糖酵解能力增强以维持其不受控的生长过阻断 B7H1 可以降低 T24 细胞系的糖酵解能力中的关键酶和信号通路蛋白的表达水平是否发细胞中蛋白，进行 Western blot 试验。我们发细胞中糖酵解关键酶的表达量均有所下降，其中PKM-2 下降 35.82%，，且均有统计学意义（非配导糖酵解途径的信号传导通路中的关键酶 Akt
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14

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本文编号：2632890