MALAT1诱导高糖刺激下的肾小管上皮细胞发生EMT和损伤及其机制研究

发布时间：2020-04-20 00:09

【摘要】：[研究目的]本研究以体外培养的人肾小管上皮细胞(Human Kidney-2 cells,HK-2 cells)为研究对象。首先,明确高糖下HK-2中的MALAT1表达升高,其后,探讨MALAT1介导高糖作用下的HK-2细胞发生上皮细胞间充质转分化(EMT)与损伤。最后,探讨MALAT1介导细胞EMT与损伤的通路机制。[研究方法]1.检测高糖刺激下HK-2细胞中MALAT1的表达:将细胞分为正常组、甘露醇组、高糖组,分别刺激12、24、36以及48小时,RT-qPCR法检测MALAT1的mRNA水平;2.MALAT1介导高糖刺激下HK-2细胞发生的EMT与损伤:转染siRNA-MALAT1及negative control siRNA,用免疫印迹法检测EMT标志蛋白E-cadherin、α-SMA 的蛋白水平,用 RT-qPCR 法检测 E-cadherin、α-SMA 以及肾小管损伤标记因子KIM-1、NGAL的mRNA水平,用ELISA法检测KIM-1、NGAL的蛋白水平;3.MALAT1在HK-2EMT和损伤中的作用机制:转染siRNA后,用免疫印迹法检测β-catenin、c-Myc、cyclin D1的蛋白水平,用细胞免疫荧光方法观察β-catenin的细胞定位;随后,分组分为正常组、甘露醇组、高糖组、LiC1组、HG+DKK-1/DKK-1组,检测细胞EMT、损伤及Wnt/β-catenin标志物的表达;最后,将组别分为高糖+siRNA-MALAT1组、高糖+siRNA-MALAT1+LiC1组、高糖+siRNA-MALAT1+DKK-1组,检测EMT标志物的mRNA、蛋白水平及Wnt/β-catenin标志物的蛋白水平。[结果]1.高糖诱发HK-2细胞中的MALAT1表达增加RT-qPCR结果显示:高糖组中MALAT1的表达随时间增加逐渐升高,其中36小时达到高峰,而甘露醇对HK-2的MALAT1的表达几乎无影响。2.MALAT1介导高糖诱发的HK-2细胞的EMT和损伤免疫印迹结果和RT-qPCR结果显示:高糖诱导HK-2的E-cadherin下降,α-SMA升高,在转染siRNA-MALAT1后,该现象被逆转,而转染了 negative control siRNA序列的组,两者的表达与高糖组无明显差异;RT-qPCR和ELISA显示:高糖能上调KIM-1和NGAL的蛋白和mRNA水平,甘露醇对该两者无影响。转染siRNA-MALAT1后,该现象被部分逆转,而转染了negative control siRNA序列的组,两者的表达水平与高糖组无统计学差异。3.MALAT1介导HK-2细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活免疫印迹结果显示,高糖与LiC1能上调CyclinD1,c-Myc,和β-catenin的蛋白水平,而DKK-1能部分逆转高糖的这些影响,甘露醇组对HK-2细胞无此影响;最后转染siRNA-MALAT1后,CyclinD1,c-Myc,和β-catenin的蛋白水平下调,而转染了negative control siRNA序列和高糖组之间这些蛋白的表达无统计学差异。4.MALAT1通过激活Wnt/β-catenin信号通路介导HK-2细胞的EMT敲除MALAT1后加入LiC1,部分升高的E-Cadherin与部分降低的α-SMA又重新被诱发降低与升高,而加入DKK-1后,部分升高的E-Cadherin与部分降低的α-SMA得到进一步的缓解。5.MALAT1可能不通过激活Wnt/β-catenin信号通路介导HK-2细胞的损伤加入LiC1之后,RT-qPCR和ELISA的结果显示,KIM-1与NGAL的表达相对于正常组有明显的下调趋势,而加入DKK-1之后,其表达与高糖组无明显差异。提示MALAT1升高能诱发肾小管上皮细胞的损伤,而激活Wnt/β-catenin信号通路可能对HK-2的损伤因子有着保护的作用。[结论]高糖通过上调MALAT1的表达诱导HK-2细胞发生EMT与损伤,其中发生EMT机制可能与MALAT1异常激活Wnt/β-catenin信号通路有关,但是MALAT1可能并不直接通过激活Wnt/β-catenin信号通路介导HK-2细胞的损伤。
【图文】：

细胞的,甘露醇,渗透压,表达水平

１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ。结果显示，与正常组相比，随着高糖作用时间的延长，ＨＫ－２逡逑细胞中的ＭＡＬＡＴ１的ｍＲＮＡ表达水平也逐渐升高，其中３６ｈ时达到峰值，而逡逑与之渗透压相等的甘露醇组的ＭＡＬＡＴ１无明显变化（图１，Ｐ＜０．０５；统计结果：逡逑表１），，说明这些变化与渗透压无关。逡逑□邋１２ｈ逡逑0邋３－１邋□邋２４邋ｈ逡逑Ｉ逦灥邋３６ｈ逦＊逡逑Ｚ邋？邋Ｈ邋４８ｈ逦＿逦＊逡逑ＩＩ逦２－逦ｉ逡逑Ｔ邋ｔ逦Ｉ逡逑１－邋ｎｎｌｌ邋ｎＲ邋ｆｌｓ邋］邋ｉｌｌ逡逑ｒｊｉｉ邋ａａｕ逡逑一邋ｗｉｉｉｉｌｌｉ邋１１逦１１１逡逑图１高糖使ＨＫ－２细胞的ＭＡＬＡＴ１表达增高（ＲＴ－ｑＰＣＲ）逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｈｉｇｈ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋ｅｎｈａｎｃｅｄ邋ＭＡＬＡＴ１邋ｉｎ邋ＨＫ－２邋ｃｅｌｌｓ逡逑将人ＨＫ－２细胞作用于正常培养基组（５．５ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖）、甘露醇组（５．５ｍｍｏｌ／Ｌ葡逡逑萄糖＋２４．５ｍｍｏｌ／Ｌ甘露醇）与高糖组（３０ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖），分别共同孵育１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、逡逑４８邋ｈ。在相应时间点收集细胞，提取ＲＮＡ，进行荧光定量ＰＣＲ，检测ＭＡＬＡＴ１的ｍＲＮＡ逡逑的表达水平。结果的统计数据均以均数±标准差表示

序列,最佳序列,转染,转染效率

别是邋ＭＡＬＡＴ１邋ｓｉＲＮＡ－３０９７邋与邋ＭＡＬＡＴ１邋ｓｉＲＮＡ－６１０８邋序列，转染效率分别是邋７１％、逡逑６６％，而ＭＡＬＡＴｌｓｉＲＮＡ－５６３９序列与正常对照组无明显统计学差异，转染效率逡逑仅为３０％（图２，邋Ｐ＜０．０５，统计结果：表２）。故而本实验选择ＭＡＬＡＴ１邋ｓｉＲＮＡ－３０９７逡逑序列作为后续实验的最优序列。逡逑２４逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】