AMPK-mTOR-ULK1诱发的自噬抑制OA对膀胱癌细胞的促凋亡效应

发布时间：2020-04-20 17:46

【摘要】：目的:研究齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)在人膀胱癌细胞中的抗肿瘤能力,以及自噬在此过程中发挥的作用。方法:用不同浓度OA处理人膀胱癌细胞系T24和EJ,CCK8实验、平板克隆形成实验检测细胞活性、细胞增殖能力;用流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blotting检测凋亡相关蛋白BAX,Bcl-2,Caspase-3表达水平。用m Cherry-GFPLC3B自噬双标腺病毒转染细胞,荧光显微镜下监测OA对细胞自噬水平的影响,Western blotting检测LC3B-Ⅱ表达变化;Western blotting检测p-AMPK、p-m TOR、p-ULK1等蛋白表达变化;通过自噬抑制剂3-甲基嘌呤(3-MA)、以及应用si RNA ATG7和baflomycin A1抑制自噬后观察OA引起的凋亡变化;用自噬诱导剂雷帕霉素诱导自噬后观察OA引起的凋亡变化;用AMPK抑制剂dorsomorphin抑制AMPK,观察OA引起的保护性自噬的改变。结果:CCK-8实验和平板克隆实验证明OA可抑制T24及EJ细胞活性和增殖能力;流式细胞仪发现OA可诱导T24及EJ细胞发生凋亡,且具有浓度依赖性;OA可通过AMPK-m TOR-ULK1通路激活细胞自噬;抑制自噬或抑制AMPK可促进OA引起的细胞凋亡,而激活自噬或激活AMPK则可抑制OA引起细胞凋亡。结论:OA在膀胱癌细胞中可发挥抗肿瘤效应,同时通过AMPK-mTOR-ULK1通路激活细胞自噬并与细胞耐药相关,联合应用OA及自噬抑制剂为膀胱癌的治疗提供了新的策略。
【图文】：

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文结果1．OA 抑制两种人膀胱癌细胞的活性和增殖能力加入 OA 培养 24 小时后，，两种人膀胱癌细胞系 T24 和 EJ 生长活性受抑制，且 OA 抑制细胞存活的效应随着其浓度增加而增强，具有浓度依赖性（图1A）。在此基础上，选取 7.5μM 和 15μM 作为合适浓度进行下面实验。集落形成实验表明 OA 抑制了 T24 细胞和 EJ 细胞的增殖能力，且 OA 抑制细胞增值能力的效应随其浓度增加而增强（图 1B、1C）。

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文0.05 ，**p < 0.012．OA 诱导人膀胱癌细胞凋亡选取未使用 OA 培养及分别使用 7.5μM 和 15μM OA 培养的 T24 细胞和EJ 细胞，使用 Annexin V-FITC 和 PI 试剂盒对细胞进行染色，后置于流式计数仪中检测。结果表明，OA 增加了凋亡细胞的数量，且随其浓度增加凋亡细胞数量增加（图 2A、2B）。为进一步了解 OA 引起的细胞凋亡机制，因此我们检测了 OA 对于一些凋亡相关蛋白的影响，发现促凋亡蛋白 BAX 和 cleavedcaspase-3 表达增加，而抗凋亡蛋白 BCL-2 表达减少（图 2C）。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14

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本文编号：2634788