缺氧肾小管上皮细胞Src活化对MMP-2活性的影响及机制研究

发布时间：2020-04-21 01:07

【摘要】：慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)为威胁人类健康的世界性临床医学难题。在CKD早期,肾脏功能处于代偿期,但随着病情进展,最终将变为终末期肾脏病(End stage renal disease,ESRD),肾脏功能完全丧失,此时肾脏组织的主要病理变化包括肾小球硬化,肾小管萎缩以及肾间质纤维化等,其中肾间质纤维化被认为是所有CKD的最终结局。在肾间质纤维化的发展过程中,基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)起了十分重要的作用。CKD早期MMP-2活性升高,促进肾小管上皮细胞的间充质转化,导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)产生增多;随着CKD的进一步发展,MMP-2表达增加但活性降低,最终使得ECM的合成多于降解,促进肾间质纤维化。在CKD晚期,MMP-2活性降低的具体机制不清。已知缺氧是导致肾间质纤维化的重要原因;且MMP-2的活化主要在胞膜表面进行,活化后MMP-2才可发挥功能,因此膜结构重塑可能影响MMP-2的活性。缺氧细胞内吞活跃,细胞膜结构重塑加强。那么CKD晚期,MMP-2的活性下降是否与缺氧导致的内吞活动加强有关?我们前期工作证实,缺氧时人近端肾小管上皮细胞(HK-2)内吞加强,上清中MMP-2活性减低;而抑制其内吞关键基因Caveolin-1后MMP-2活性增高。因此我们提出,缺氧时HK-2细胞内吞加强,使MMP-2的活化受影响,导致MMP-2活性下降,从而加重肾间质纤维化。但内在机制有待明确。Src是酪氨酸蛋白激酶家族的重要成员,缺氧可致Src磷酸化[phospho-Src(Tyr416)]。p-Src(Tyr 416)分子可调节多种与纤维化相关的膜受体信号通路,如:TGF-β/Smad、STAT3、EGFR等通路。已有研究证实,当Src在Tyr 416位点的活化被抑制后,肾间质纤维化可得到显著缓解。那么肾间质纤维化过程中细胞内吞所致的MMP-2的活性变化与Src之间有无联系?在肾间质纤维化时,肾组织中因缺氧而活化的Src分子是否可能通过促进细胞内吞而干扰MMP-2的活化?为解决这些问题,我们开展了以下研究。首先通过改良方法建立环孢素A(Cyclosporin A,Cs A)诱导的缺氧性小鼠肾间质纤维化模型,并对该方法进行评估。在初步成功的基础上,又建立了Cs A诱导的大鼠肾间质纤维化模型,从整体水平观察了纤维化肾脏组织中MMP-2的活性、细胞内吞调节分子Caveolin-1以及Src分子的表达变化情况。然后通过体外实验进一步对Src调节MMP-2活性的机制进行研究。利用缺氧培养HK-2细胞,模拟肾纤维化组织的缺氧微环境,并利用Src活化的选择性抑制剂PP1干扰Src活化;检测Src、Caveolin-1、内吞以及MMP-2的活性变化情况。了解Src是否通过促进细胞内吞而对MMP-2的活化产生干扰。第一部分利用改良方法建立小鼠及大鼠缺氧性肾间质纤维化模型Ⅰ.利用改良方法建立小鼠缺氧性肾间质纤维化模型目的Cs A诱导的小鼠缺氧性肾间质纤维化是建立缺氧性肾间质纤维化模型的常用方法之一。传统的建模方法为小鼠皮下注射Cs A,同时饲喂0.01%低钠饲料。但目前Cs A的临床应用多以口服为主,因此若以灌胃法建模能更准确的模拟临床。同时在建模过程中低钠饲料必不可少,但其价格高,制作费时,且含钠量有时难以达到如此低的要求;而呋塞米是临床常用药物,简单易得,有强大的排钠作用,可以很好的模拟低钠环境。因此本研究拟利用灌胃法替代皮下注射法,同时利用呋塞米替代低钠饲料,为该模型的建立提供一种改良的方法。方法小鼠随机分为Cs A+呋塞米组、Cs A组、呋塞米组、葵花籽油组、蒸馏水组、空白对照组等6组。日常观察小鼠一般情况,每4 d记录一次小鼠体重变化,并根据体重调整药量。第14 d和28 d时各组随机选取6只小鼠,利用代谢笼收集尿液后,处死小鼠并取血及肾脏组织标本。观察肾脏大体病理形态;检测血钠以及尿钠;检测血肌酐、尿素氮、尿蛋白、肌酐清除率等肾功能指标;利用Hematoxylin-Eosin(HE)染色、Masson-trichrome(Masson)染色、Periodic Acid-Schiff(PAS)染色等方法行肾脏病理检查;利用Western blotting方法检测各组Vimetin了解肾脏纤维化程度;利用免疫组织化学染色检测各组肾素分泌情况;Western blotting方法还被用于检测缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达,以了解肾组织缺氧情况。结果14 d及28 d时较其余各组,仅Cs A+呋塞米组小鼠肾脏出现了明显的纤维化表现;同时该组血钠较余组减低,尿钠较余组增高;且该组肾功能指标较余组明显异常;免疫组织化学染色显示仅Cs A+呋塞米组小鼠的肾脏组织中有明显的肾素分泌;Western blotting也显示仅该组小鼠的肾脏组织中有明显的Vimentin以及HIF-1α表达。结论利用Cs A与呋塞米联合灌胃的方法成功建立了小鼠缺氧性肾间质纤维化模型。Ⅱ.利用改良方法建立大鼠缺氧性肾间质纤维化模型目的在实验I中我们利用Cs A与呋塞米联合灌胃的方法成功建立了改良的小鼠缺氧性肾间质纤维化模型。但由于小鼠肾脏体积小,每次可取新鲜组织的量有限,而后续机制部分的实验需要较多新鲜肾脏组织;同时也为了验证该方法的普适性。故我们拟利用改良方法建立大鼠缺氧性肾间质纤维化模型,并对造模结果进行评估。方法在实验I的基础上对大鼠分组进行优化,将SD大鼠随机分为Cs A+呋塞米组、Cs A+蒸馏水组、呋塞米+葵花籽油组、空白对照组等4组。日常观察大鼠一般情况,定期记录大鼠体重变化,并根据体重调整药量。第14 d和28 d时各组随机选取6只大鼠,利用代谢笼收集尿液后,处死大鼠并取血及肾脏组织标本。观察肾脏大体病理形态;检测血肌酐、尿素氮、尿蛋白、肌酐清除率等肾功能指标;利用HE染色、Masson染色、PAS染色等方法行肾脏病理检查;利用免疫组织化学染色检测各组Vimetin了解肾脏纤维化程度;利用Western blotting方法检测各组HIF-1α的表达,以了解肾组织缺氧情况。结果14 d及28 d时较其余各组,仅Cs A+呋塞米组大鼠肾脏出现了明显的纤维化表现;且该组肾功能指标较余组明显异常;免疫组织化学染色显示仅Cs A+呋塞米组大鼠的肾脏组织中Vimentin阳性细胞增加;Western blotting也显示仅该组大鼠的肾脏组织中有明显的HIF-1α表达。结论利用Cs A与呋塞米联合灌胃的方法成功建立了大鼠缺氧性肾间质纤维化模型。第二部分大鼠肾脏组织中p-Src(Tyr 416)表达与MMP-2活性的相关性观察目的从整体水平观察各组大鼠肾脏组织中MMP-2的活性,细胞内吞调节分子Caveolin-1以及Src分子的表达变化情况;并对大鼠肾脏组织中p-Src(Tyr 416)的表达与MMP-2活性间的相关性进行观察。方法将留取的4组大鼠的新鲜肾脏组织裂解并提取蛋白。之后利用Western blotting方法检测各组中MMP-2、膜型基质金属蛋白酶-1(Membrane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP)、伴有Kazal基序的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(Reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs,RECK)、金属蛋白酶组织抑制因子-2(Tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)、Caveolin-1、p-Src(Tyr 416)等的蛋白表达情况;并利用明胶酶谱法检测各组中MMP-2的活性变化情况。最后对p-Src(Tyr 416)的表达与MMP-2活性间的相关性进行观察。结果纤维化(Cs A+呋塞米组)的大鼠肾脏组织中MMP-2、RECK、TIMP-2、Caveolin-1、p-Src(Tyr 416)的表达较其余各组明显升高;但该组中MT1-MMP的表达以及MMP-2的活性较其余各组明显减低;p-Src(Tyr 416)的表达与MMP-2的活性间存在负相关。结论在整体水平,p-Src(Tyr 416)的表达与MMP-2的活性间存在负相关性,p-Src(Tyr 416)可能通过促进细胞内吞而对MMP-2的活化产生干扰。第三部分p-Src(Tyr 416)调节MMP-2活性的机制研究目的通过对HK-2细胞的缺氧培养来模拟肾纤维化组织的缺氧微环境,并利用Src活化的选择性抑制剂PP1干扰Src活化;检测p-Src(Tyr416),内吞水平,Caveolin-1,以及MMP-2的活性变化情况,了解Src是否通过促进细胞内吞而干扰MMP-2的活化。方法将HK-2细胞分为常氧组、缺氧组、缺氧+DMSO组以及缺氧+PP1组。并利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞毒性实验确定PP1的用量以及作用时间。之后利用Western blotting方法对各组中HIF-1α、MMP-2、RECK、TIMP-2、MT1-MMP、p-Src(Tyr 416)、Caveolin-1的表达情况进行检测。并利用染料FM4-64FX直接观察各组的内吞活动情况。再利用免疫荧光法进一步验证各组中RECK、TIMP-2、MT1-MMP的表达情况。最后利用明胶酶谱法对各组上清中MMP-2的活性进行检测。结果相较常氧组,缺氧组中p-Src(Tyr 416)、Caveolin-1表达升高,内吞活动加强;MMP-2活性调节相关蛋白RECK和TIMP-2表达升高,MT1-MMP表达减低;MMP-2活性下降。相较缺氧组,缺氧+PP1组中p-Src(Tyr 416)、Caveolin-1表达减低,内吞活动减弱;MMP-2活性调节相关蛋白RECK和TIMP-2表达下降,MT1-MMP表达升高;MMP-2活性增强。结论缺氧促进Src的磷酸化,活化的Src可以促使HK-2细胞内吞活动加强,影响MMP-2的活化,导致MMP-2活性下降,加重肾间质纤维化。
【图文】：

调控机制,化生,细胞因子

1. MMP-2 的表达和活性调控。调控机制非常复杂。例如，Notch、P38MAPK 以及 TGF-/Smad 等细胞信号通路，可以调控 pro-MMP-2 的产生。TIMP-2、MT1-MMP 在 pro-MMP-2化生成 MMP-2 的过程中起了十分重要的作用。此外，RECK、TIMP-2、内吞、Src 的活和细胞因子也参与了 MMP-2 的活性调控。igure 1. The regulation of activity and expression of MMP-2. The regulation mechanism isomplicated. The signal pathways, such as Notch, P38MAPK and TGF-β/Smad, regulate theroduction of pro-MMP-2. TIMP-2 and MT1-MMP also play an important role in the activation ofro-MMP-2 to MMP-2. Additionally, RECK, TIMP-2, endocytosis, Src activation and cytokineslso play an important part in the activity regulation of MMP-2.

肾脏,肾间质纤维化,细胞因子,内吞作用

图 2. 在 CKD 早期，当肾脏受损伤时，受损伤的肾脏细胞以及炎细胞可以分泌多种与促炎和促纤维化相关的细胞因子，，这些细胞因子可以促进肾间质纤维化的发生。此时，MMP-2的活性增高，肾脏基底膜受损伤，从而可促进肾小管上皮细胞间充质转化，最终导致 ECM大量产生、聚积。然而，在 CKD 晚期，MMP-2 的活性减低，从而导致 ECM 的降解不足。因此，肾间质纤维化很难逆转。CKD 晚期 MMP-2 活性下降的原因可能与缺氧引起的内吞作用增强有关。①CKD 早期；②CKD 晚期。Figure 2. In the early stage of CKD, when the kidney is injured, the injured cells and theinflammatory cells in kidney will secrete a variety of pro-inflammatory and pro-fibrotic cytokines,which promote the occurrence of renal interstitial fibrosis. Meanwhile, the activity of MMP-2 isincreased and the renal basement membrane injured, promoting the phenotype transformation ofrenal tubular epithelial cells, at last resulting in the aggravation of ECM deposition. However, inthe advanced stage of CKD, the activity of MMP-2 is decreased and leads to inadequatedegradation of ECM; therefore, the fibrosis is difficult to reverse. The reason for the activity
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

【参考文献】