三种途径移植骨髓间充质干细胞治疗阿霉素肾病大鼠的可行性研究

发布时间：2020-04-21 06:30

【摘要】：[目的]1、培养、提纯与标记SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),用于后续进行同种异体输注治疗。2、建立类似于人类慢性肾脏病的阿霉素肾病大鼠模型。3、通过不同途径移植标记后的BMSCs,并通过观察移植后大鼠的肾功能改善、肾脏组织中BMSCs的分布从而分析疗效最优通道。继而对临床上对于慢性肾脏病的治疗工作提供借鉴意义。[方法]1、选择2只雄性12周龄清洁级SD大鼠,取骨髓作供体细胞来源。将其处死后,在无菌条件下取出股骨及胫腓骨,从其骨髓腔内提取BMSCs进行分离、提纯,由流式细胞学鉴定,确定为目标所需细胞后,传代培养至P4-P6,用Ad5/F35腺病毒载体(带绿色荧光)转染液标记。2、随机选择60只雄性14周龄清洁级SD大鼠,切除左肾并于手术当天、1周后、2周后,通过尾静脉以3mg/kg剂量输注阿霉素建立慢性肾病模型。同时选择12只大鼠作为空白对照。末次输注阿霉素后第4周,对造模后大鼠的尿蛋白、血生化进行分析。3、选择成功造模的48只大鼠,随机分为4组,每组12只:A组:经动脉介入途径输注BMSCs并在两周后于同一路径输注等量BMSCs;V组:经尾静脉途径输注BMSCs并在两周后于同一路径输注等量BMSCs;IP组:经腹腔注射途径输注BMSCs并在两周后于同一路径输注等量BMSCs;骨髓间充质干细胞的量为1X 106个/ml混悬液2.5ml。ADR组:不输注BMCSs,仅在其他组输注BMSCs时通过尾静脉输注等量生理盐水。12只健康大鼠作为空白组N组,同样在其他组输注BMSCs时经尾静脉输注2.5ml生理盐水。分别于末次移植后0周(当周)、1周、2周取血。检测大鼠血液中血红蛋白和血肌酐,收集24h尿液检测24h尿蛋白。并在此三个时间点每组取4只大鼠(A组前两次分别只取3只)处死取出右肾组织观测BMCSs在肾内的分布情况。[结果]1、最初的骨髓间充质干细胞呈典型的贴壁生长特性(24-48小时),传代1周后,细胞呈圆形、不规则多角形,仅有少数呈长梭形。传至P4代时,BMSCs生长速度加快,细胞形态规则,呈长梭形。取传代至P4至P6的BMSCs做流式细胞仪表型鉴定,其中CD45、CD11b、CD29及CD44表面标志阳性表达分别为2.2%、1.9%、97.1%、和97.9%。AD5/F35腺病毒转染后6小时,换培养液培养一天后观察绿色荧光的表达率为75%。2、造模时死亡5只,造模失败3只,成功造模52只,取2只处死进行肾脏病理切片,取2只作为后续实验A组插管失败导致死亡的补充。末次输注阿霉素后第4周,造模后大鼠检测血肌酐及血尿素氮明显上升,24h尿蛋白升高,血清白蛋白下降。观察病理切片:肾脏形态呈硬化、萎缩状,部分肾小球出现局灶性硬化,肾小管管腔扩张,肾间质有炎症、纤维化表现。通过实验室检查与病理改变,说明大鼠造模成功。3、A组进行第一次BMSCs移植时,术后失血过多死亡1只,补充1只造模成功大鼠;第二次骨髓间充质干细胞移植术中死亡1例,术后死亡1例。V组和IP组无死亡病例。移植后A组、V组、IP组和ADR组在0、1、2周时,血肌酐、血尿素氮、24小时尿蛋白指数均明显高于N组(P0.01)。0周时,A组、V组、IP组与ADR组比较,血肌酐、血尿素氮、24小时尿蛋白均无明显改变。1周时A组血清肌酐明显低于ADR组(P0.01),而V组和ADR组血清肌酐无明显改善;一周时与ADR组比较,A组和V组的24小时尿蛋白均有降低,且A组24小时尿蛋白明显低于V组(P0.01)。2周时,血肌酐数值A组低于V组和阿霉素组(P0.01),但V组与ADR组无显著性差异;A组和V组24小时尿蛋白低于ADR组(P0.01),A组与V组无显著性差异。各个时间节点上IP组与ADR组比较,各项指标无明显差异。病理学检查显示,ADR组和IP组出现局灶性肾小球硬化硬化,基底膜和系膜细胞增生,间质部分有大量炎性细胞;V组的肾小球基膜及系膜细胞出现不同程度增生,间质部分少量炎性细胞浸润;A组大部分肾小球出现毛细血管襻扩张,间质部分极少量炎性细胞浸润;N组病理显示与正常大鼠肾脏病理一致。检测绿色荧光显示:N组、ADR组、IP组基本没有显示绿色荧光;V组、A组于移植后第一天起即出现绿色荧光,并随时间推移逐渐增强,于14天时为最强;V组绿色荧光主要表达于肾小管部分,而A组不仅分布于肾小管,同时在肾小球部分也可看见少量分布。[结论]1、通过细胞特征检测,获得细胞为高纯度的骨髓间充质干细胞,是实验所需的目标细胞,使用腺病毒转染后可成功使其带有绿色荧光。2、单侧肾切除和3次经尾静脉输注阿霉素可引起大鼠慢性肾脏病。此方法较为安全,是一种可重复、稳定、有效的造模方法。3、移植同种异体的BMSCs因输注途径不同可对慢性肾脏病大鼠产生不同情况的治疗效果:腹腔注射不能改善肾功能,动脉介入途径及外周静脉输注均可对大鼠肾功起到改善的效果,且通过动脉途径的效果优于外周静脉途径效果。改善肾功的具体表现在于抑制大鼠的血尿素氮、血肌酐升高;提高血红蛋白,改善贫血;降低尿蛋白量,提高血清白蛋白。
【图文】：

细胞形态,表面标志,腺病毒,培养细胞

ＣＤｌｌｂ的阳性率表达仅有２．邋２％、１．邋９％，而ＣＤ２９及ＣＤ４４表面标志阳性表达高达逡逑９７．邋１％和邋９７．邋９％。逡逑经过ＡＤ５／Ｆ３５腺病毒转染后６小时，换培养液培养一天后观察绿色荧光的表逡逑达率为７５％，细胞和正常培养细胞的形态一致，呈多边形，无显著差异（图１－２）。逡逑

肾动脉造影,间充质干细胞,手术时间,肾动脉

图２．邋２－１造模后大鼠肾组织ＨＥ邋（Ｘ１００）图２．邋２－２造模后大鼠肾组织ＨＥ邋（Ｘ２００）逡逑３．介入途径肾动脉造影结果逡逑Ａ组第一次行介入途径肾动脉插管移植骨髓间充质干细胞时，由于手术时间逡逑过长，导致术后失血过多／感染，，导致一例死亡，由造模后剩余２只大鼠随机选逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

【参考文献】