沙格列汀通过SDF-1α抑制2型糖尿病大鼠足细胞转分化的机制研究

发布时间：2020-04-26 15:15

【摘要】：目的糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)作为常见的糖尿病微血管并发症,已成为全世界终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因。降糖策略被认为是保护肾脏的主要方式,然而仍有一部分病人肾功能在有效降糖后仍然恶化。因此,寻找一种既能有效降糖又能阻止DKD进展的药物迫在眉睫。沙格列汀作为二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)抑制剂已成为治疗2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)的新型药物。沙格列汀对肾脏具有保护作用,而其确切机制尚未明确。DPP-4具有酶活性,SDF-1α是DPP-4的天然底物,DPP-4可将有活性的SDF-1α降解为失去活性的SDF-1α,而沙格列汀作为DPP-4抑制剂,能够抑制SDF-1α降解。SDF-1α对肾脏具有保护作用,可激活下游因子PKA磷酸化。氧化应激与DKD的病理生理机制密切相关,能够被PKA磷酸化所抑制。足细胞转分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是导致蛋白尿的潜在途径,氧化应激可促进足细胞EMT。本研究以高脂饲料(high fat diet,HFD)联合链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的T2DM大鼠和条件永生性小鼠足细胞系为研究对象,通过体内和体外实验,研究并探讨沙格列汀通过抑制DPP-4酶活性,阻止SDF-1α降解,改善氧化应激和足细胞EMT,预防DKD的机制。方法1.体内动物实验:本实验将45只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠适应性喂养1周后,随机选取15只给予给予标准饲料(chow diet,CD)喂养,为CD组,其余30只SD大鼠给予高脂饲料喂养,为HFD组。喂养10周后,监测各组大鼠体重、血糖、血脂、肾功能、肝功能等指标,并通过腹腔糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)实验评估胰岛素抵抗状态。随后HFD组大鼠给予小剂量STZ 25mg/kg尾静脉注射。以血糖≥16.7mmol/l作为诱导T2DM模型成功标准。造模成功后,将T2DM大鼠随机分为糖尿病模型组(DM)和沙格列汀干预组(DM+Sax),给予标准饲料喂养的15只大鼠继续标准饲料喂养,为空白对照组(NC)。每周监测每组大鼠体重、血糖,12周末留取24h尿检测尿微量白蛋白(urine microalbumin,UMA)。沙格列汀治疗12周后处死大鼠,留取血标本检测各组大鼠血脂、肾功能、肝功能等指标。左肾迅速摘除并称重。通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠尿中氧化应激标记分子8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG)、尿足细胞损伤分子Mindin水平。应用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色和过碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff staining,PAS)观察各组大鼠肾脏基本结构和细胞外基质沉积。借助电镜观察各组大鼠足细胞基本结构。应用生物样品DPPIV/CD26检测试剂盒检测各组大鼠血清和肾脏中DPP-4酶活性。应用免疫荧光染色观察肾脏组织切片Desmin、Nephrin、Podocin、DPP-4表达。通过免疫组织化学染色检测肾脏组织切片中Fibronectin、Fsp1、SDF-1α、NOX2表达。采用DHE染色观察各组大鼠ROS水平。采用western blot法检测各组大鼠肾脏DPP-4、SDF-1α、p-PKA、PKA、NOX2、p-ERK1/2、ERK1/2、TGF-β1、α-SMA、Desmin、Nephrin、Podocin蛋白水平。2.体外细胞实验:条件永生性小鼠足细胞系在33℃含IFN-γ培养条件下增殖,37℃无IFN-γ培养条件下培养10~14天诱导分化。然后将细胞分成5组:(1)正常葡萄糖组(NG)作为对照组,培养于含5.6mmol/l D-葡萄糖的RPMI 1640中;(2)甘露醇对照组(MA)作为等渗对照组,培养于含5.6mmol/l D-葡萄糖和24.4mmol/l甘露醇的RPMI 1640中;(3)高糖干预组(HG),培养于含30mmol/l D-葡萄糖的RPMI 1640中;(4)高糖与沙格列汀干预组(HG+Sax),培养于含30mmol/l的RPMI 1640中,并用500nmol/l沙格列汀处理;(5)高糖、沙格列汀及AMD3100干预组(HG+AMD3100+Sax),培养于含30mmol/l D-葡萄糖的RPMI1640培养基,并使用SDF-1α受体拮抗剂AMD3100 20μg/ml预处理后,加入沙格列汀使其浓度为500nmol/l进行干预。应用生物样品DPPIV/CD26检测试剂盒测定各组足细胞DPP-4酶活性。应用荧光探针DCFH-DA检测各组足细胞ROS水平。通过western blot法检测各组足细胞DPP-4、SDF-1α、p-PKA、PKA、NOX2、p-ERK1/2、ERK1/2、TGF-β1、Desmin、Nephrin、Podocin蛋白水平。结果一、动物实验结果1.2型糖尿病大鼠造模成功对SD大鼠分别给予标准饲料和高脂饲料干预10周后,HFD组大鼠体重和血脂较CD组大鼠明显增加(P0.05),IPGTT结果显示HFD组大鼠存在胰岛素抵抗,且经过小剂量尾静脉注射STZ后,大鼠存在明显的多饮、多尿、多食、体重减轻等症状,随机血糖≥16.7mmol/l,提示T2DM大鼠造模成功。2.沙格列汀降低2型糖尿病大鼠尿微量白蛋白给予沙格列汀治疗12周后,DM组和DM+Sax组大鼠血糖较NC组显著升高(P0.05),DM+Sax组血糖较DM组降低,但无统计学差异(P0.05)。与NC组相比,24h UMA在DM组和DM+Sax组中显著升高(P0.05),而与DM组相比,沙格列汀干预后24h UMA明显改善(P0.05)。3.沙格列汀改善2型糖尿病大鼠肾小球细胞外基质沉积和足细胞结构HE、PAS染色结果显示,NC组大鼠肾脏结构未见明显异常,表现为肾小球及肾小管结构清楚,肾小球大小未见明显异常。DM组大鼠系膜基质弥漫性增生,给予沙格列汀后有所改善。电镜结果显示,NC组大鼠足细胞结构未见明显异常,而DM组大鼠足细胞足突融合,DM+Sax组大鼠给药后足细胞结构得到一定程度恢复。4.沙格列汀抑制2型糖尿病大鼠足细胞EMT免疫荧光染色、免疫组织化学染色和western blot结果显示,DM组大鼠Fibronectin、Fsp1、TGF-β1、α-SMA、Desmin表达水平较NC组显著升高(P0.05),Nephrin、Podocin表达水平较NC组显著下降(P0.05),提示T2DM大鼠存在足细胞EMT现象。与DM组相比,沙格列汀治疗后大鼠Fibronectin、Fsp1、TGF-β1、α-SMA、Desmin表达水平明显下降(P0.05),Nephrin、Podocin表达水平明显升高(P0.05),提示沙格列汀抑制T2DM大鼠足细胞EMT现象。5.沙格列汀抑制DPP-4酶活性和SDF-1α降解与NC组相比,DM组大鼠血清和肾脏DPP-4酶活性明显升高(P0.05),而DM+Sax组大鼠血清和肾脏DPP-4酶活性较DM组明显下降(P0.05)。通过免疫荧光染色、免疫组织化学染色和western blot方法观察到,与NC组大鼠相比,DM组大鼠DPP-4表达水平显著升高(P0.05),SDF-1α表达水平显著下降(P0.05)。给予沙格列汀治疗后,与DM组大鼠相比,DPP-4表达水平显著下降(P0.05),SDF-1α表达水平显著增加(P0.05),提示沙格列汀抑制DPP-4酶活性,抑制SDF-1α降解。6.沙格列汀抑制2型糖尿病大鼠氧化应激水平通过免疫组织化学染色、DHE染色和western blot方法,本研究发现,与NC组大鼠相比,DM组大鼠PKA磷酸化水平显著下降(P0.05),NOX2、ROS、p-ERK1/2蛋白水平显著升高(P0.05)。与DM组大鼠相比,给予沙格列汀治疗后PKA磷酸化水平显著升高(P0.05),而NOX2、ROS、p-ERK1/2水平显著下降(P0.05)。二、细胞实验结果1.沙格列汀抑制高糖诱导的足细胞EMTDPPIV/CD26检测试剂盒、荧光探针DCFH-DA、western blot结果显示,沙格列汀显著抑制DPP-4酶活性和蛋白水平(P0.05),抑制SDF-1α降解(P0.05),促进PKA磷酸化(P0.05),抑制NOX2、ROS、p-ERK1/2水平(P0.05),抑制TGF-β1、Desmin表达(P0.05),改善足细胞Nephrin、Podocin表达(P0.05)。2.沙格列汀通过SDF-1α抑制高糖诱导的足细胞EMT荧光探针DCFH-DA、western blot结果显示,与HG+Sax组相比,HG+AMD3100+Sax组足细胞PKA磷酸化水平显著下降(P0.05),NOX2、ROS、p-ERK1/2水平显著升高(P0.05),TGF-β1、Desmin表达显著升高(P0.05),足细胞Nephrin、Podocin表达显著下降(P0.05)。结论1.沙格列汀独立于降糖作用改善T2DM大鼠UMA。2.沙格列汀通过抑制DPP-4酶活性,抑制SDF-1α降解,改善氧化应激,抑制足细胞EMT,阻止DKD发生发展。
【图文】：

抑制剂,机制

天津医科大学博士学位论文0%。抑制 DPP-4 酶活性，血浆中有活性的 GIP 和 GLP-1 可以增加 2 倍到 3]。DPP-4 抑制剂治疗 T2DM 中的作用在于阻止 GIP 和 GLP-1 降解，延长它作用时间（图 1B），给予 DPP-4 抑制剂使循环中的 GLP-1 双倍增加[6]。DPP制剂作用效果归因于 GLP-1 受体激动剂的作用，包括以葡萄糖依赖的方式胰岛素和抑制胰高血糖素分泌[6]。另外，，该类药物对体重影响为轻度或中度，单独使用不增加低血糖风险[7]。目前临床使用的 DPP-4 抑制剂主要有西格列汀、维格列汀、沙格列汀、列汀、利格列汀，本研究的研究对象为沙格列汀。

透射电镜,足细胞,细胞结构

6图 2 足细胞的细胞结构[32]注：（a）肾小球结构；（b）扫描电镜下的足细胞结构；（c）透射电镜下的滤过屏障结构；（d）足细胞足突结构；GBM，肾小球基底膜；E，内皮细胞；CL,毛细血管腔；M，系膜细胞；FP，足突；CB，细胞体；MP，主突；BS，Bowman 囊；AA，入球小动脉；DT，远端小管；EE，出球小动脉；PE，顶叶上皮；PT，近端小管；AMD，顶部；BMD，基底部相邻的足突由高度分化的细胞连接部在侧面链接，称为 SD，SD 是一种多蛋白复合物，由 Nephrin、Podocin 等蛋白构成，其完整性对于防止蛋白尿过滤必不可少。Nephrin 是一种 1 型跨膜蛋白，Nephrin 分子可以相互作用，使 SD 看起来像拉链，对阻止蛋白尿具有重要作用[33]。Podocin 也是一种 SD 蛋白，它通过其中心部分锚定在膜上，并帮助 Nephrin 锚定在质膜上，在阻止蛋白尿产生中发挥重要作用[33]。血浆穿过有孔的内皮细胞、GBM 和 SD，由毛细血管腔到鲍曼囊。SD 在足细胞 FP 之间的滤过孔中起连接作用，从而建立防止尿蛋白丢失的最终屏障（图 3）。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】