低氧预处理尿源性干细胞在糖尿病肾病肾组织修复中的作用

发布时间：2020-05-05 12:16

【摘要】：目的:比较健康人尿源性干细胞(Urine derived stem cell,USC)与糖尿病肾病患者尿源性干细胞(USC from patients with diabeticnephropathy,D-USC)生物学特性的差异,并探讨采取低氧(3%O_2)预处理后对两种细胞增殖、分泌和凋亡的影响,评估低氧预处理尿源性干细胞在糖尿病肾病肾组织修复中的作用。方法:收集10名年龄20-25岁之间健康男性和10名男性糖尿病肾病患者尿液样本,分离、培养USC和D-USC,通过观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物,茜素红及油红O染色分别检测成骨和成脂分化潜能,鉴定其干细胞特性;绘制生长曲线比较USC与D-USC增殖能力,人促血管生成因子检测试剂盒检测细胞外分泌因子的表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,透射电镜以及蛋白免疫印迹法检测自噬水平的差异;低氧处理后检测其增值、分泌、凋亡和自噬水平的变化。链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导下建立SD大鼠糖尿病模型,每两周通过尾静脉分别注射USC和低氧预处理尿源性干细胞(Hypoxia-preconditioned urine-derived stem cell,HP-USC),共3次,最后一次注射六周后取材,电镜及组织学检测观察肾脏病理变化。结果:原代培养约第5-6天可观察到单个、“米粒样”USC和D-USC克隆形成,此类细胞可以在体外分离培养,连续传代生长,细胞形态保持米粒状,表达间充质干细胞标志物(包括CD 24、CD 29、CD 73、CD 90、CD 105),周细胞标志物(CD 146),不表达造血干细胞标志物(包括CD 31、CD 34、CD 45),具有成骨和成脂分化的潜能;与USC相比,D-USC的增殖能力受到损伤,分泌因子种类基本保持一致,但数量上有所减少,细胞凋亡率升高,自噬水平较高;同常氧培养条件相比,USC和D-USC在低氧条件下能获得明显更多的细胞克隆,且其增值能力,旁分泌功能等明显优于常氧条件下的USC和D-USC,而凋亡现象减少,自噬水平降低。电镜和组织学检测提示USC和HP-USC治疗组老鼠肾小球损伤及炎症和纤维化程度都低于造模组,且低氧组效果相对于常氧组更好。结论:(1)成功从糖尿病肾病患者尿液中提取出尿源性干细胞,与USC特性一致,但增殖和分泌能力受损,凋亡增多,自噬水平较高;(2)3%O2低氧条件培养,能够提高USC和D-USC增殖、分泌功能,而抑制其凋亡的发生,降低细胞内自噬水平;(3)低氧预处理能增强USC在糖尿病肾病进展中的作用,更好地修复肾损害。
【图文】：

细胞形态,表面标志,阳性率,间充质干细胞

图 1.1 不同代 USC 和 D-USC 的细胞形态Fig.1.1 Morphology of USC and D-USC at different passages2.2 USC 和 D-USC 细胞表面标志物的表达采用流式细胞术检测了 USC 和 D-USC 细胞表面标志物的表达情况。结果显示，两种细胞都表达间充质干细胞表面标志物 CD 24、CD 29、CD 73、CD 90、CD 105，USC 阳性率分别为 98.6%、99.9%、61.5%、77.6%、1.65%，D-USC 阳性率分别为 92.0%、99.6%、88.6%、36.1%、1.39%。两种细胞都表达周细胞表面标志 CD 146，USC 阳性率为 98.5%，D-USC 阳性率为 76.8%。两种细胞都不表达造血细胞的表面标志 CD 31、CD 34 和 CD 45(图 1.2)。该结果表明，从病人尿液中分离提取的细胞比较符合间充质干细胞的特点，，与 USC 表达的表面标志物没有明显差异。

流式细胞术,检测结果,细胞,矿盐

19图 1.2 细胞表面标志物的流式细胞术检测结果Fig.1.2 Surface markers in cells analyzed by flow cytometry2.3 USC 和 D-USC 成骨与成脂诱导观察细胞经成骨诱导后，细胞形态在第 4 天发生变化，呈方型，第 8 天时变化明显，呈鹅卵石样，第 21 天细胞变为多角状，间质内大量矿盐沉积形成钙化结节。第 21 天时用 4%多聚甲醛固定细胞，经 0.1%茜素红染色后，可见明显的红色结节，
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R692.9

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