骨髓源性生长因子（MYDGF）在糖尿病肾病足细胞损伤中的保护作用

发布时间：2020-05-09 05:17

【摘要】：研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常见的并发症,也是导致终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的重要原因。但是,糖尿病肾病的发病机制尚不完全清楚,更为重要的是目前临床上缺乏治疗糖尿病肾病有效药物。因此,寻找新型潜在的治疗靶点,对于糖尿病肾病的临床治疗具有重要意义。足细胞(podocyte),即肾小囊脏层上皮细胞,是构成肾小球血液滤过屏障重要成分,在维持肾小球的正常功能方面发挥了重要作用。足细胞损伤在糖尿病肾病的发生和发展过程中发挥着关键作用,主要表现为足细胞数量和密度减少、足细胞肥大变性以及足突融合和消失。所以改善足细胞损伤和寻找有效的治疗靶点对于糖尿病肾病的治疗具有非常重要的意义。骨髓源性生长因子(Myeloid-derived growth factor,MYDGF)是一种新型的分泌型生长因子,最近的研究表明MYDGF在急性心肌梗塞(acute myocardial infarction,AMI)的发病过程中具有重要的保护作用。但是,MYDGF在肾脏的表达功能,特别是在糖尿病肾病中发生发展中的作用,迄今未见报道。因此,探究MYDGF在糖尿病肾病中的作用,对于阐明糖尿病肾病发病机制,寻找有效的临床治疗靶点具有重要意义。研究目的1.表征MYDGF在糖尿病肾病中的表达变化,明确MYDGF是否是通过影响足细胞来参与糖尿病肾病的发生和发展。2.初步探讨MYDGF在糖尿病肾病足细胞损伤中的功能和机制。研究方法第一部分:MYDGF在糖尿病肾病中的表达变化1.利用RT-PCR和Real-time RT-PCR方法检测在雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠主要脏器和不同肾脏实质细胞中MYDGF的表达情况首先取出WT小鼠各器官,通过RT-PCR和Real-time RT-PCR方法检测MYDGF在小鼠各脏器中的mRNA含量。体外培养人肾小球足细胞(human podocyte,HPC)、小鼠肾小球足细胞(mouse podocyte,MPC)、人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cell,HK-2)、大鼠系膜细胞(rat messangial cell,RMC)和大鼠肾小球内皮细胞(glomerular endothelial cell,GENC),通过RT-PCR和Real-time RT-PCR方法检测MYDGF在各种肾脏实质细胞中的表达变化。2.验证链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病肾病小鼠模型的建立选取10周龄左右的雄性野生型C57BL/6J小鼠,单肾摘除后培养一周,腹腔注射STZ,剂量为100mg/kg,连续注射三天诱导糖尿病肾病。使用血糖仪检测小鼠末梢静脉全血中葡萄糖浓度(glucose,GLU),测量肾重、计算肾重比(Relative kidney weight,RKW)以及通过ELISA试剂盒检测糖尿病小鼠尿白蛋白和肌酐(urinary albumin:creatinine ratio,UACR),同时用过碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain,PAS)和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)的方法检测糖原沉积和Nephrin、Podocin的表达量。通过以上指标和方法来验证糖尿病肾病模型造模成功。3.db/db小鼠相关生理指标的表征我们购买了一批db/db 16周小鼠。使用血糖仪检测小鼠GLU,测量肾重、计算RKW以及通过ELISA试剂盒检测糖尿病小鼠UACR,同时用PAS染色和免疫荧光的方法检测糖原沉积和Nephrin、Podocin的表达量。通过以上指标和方法来验证糖尿病肾病模型造模成功。4.检测在糖尿病肾病小鼠肾皮质中MYDGF的表达情况当小鼠模型构建成功后,通过Real-time RT-PCR和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)的方法检测MYDGF在糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达变化。5.糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)刺激不同肾脏实质细胞后检测MYDGF的表达水平变化体外培养HPC、MPC、HK-2、RMC和GENC,分别给予AGE刺激48小时后抽提细胞内蛋白,进行免疫印迹分析,检测在AGE刺激下MYDGF在不同肾脏实质细胞中的蛋白表达变化。6.体外AGE刺激下检测在不同肾脏实质细胞上清液中MYDGF的表达变化体外培养HPC、MPC、HK-2、RMC、GENC和分别给予AGE刺激48小时后取细胞上清液,通过ELISA方法检测在不同肾脏实质细胞培养上清液中MYDGF的表达变化。7.利用免疫荧光方法检测MYDGF在糖尿病肾病小鼠肾脏的表达分布及变化选取10周龄左右的雄性野生型C57BL/6J小鼠,单肾摘除恢复一周后,腹腔注射STZ,剂量为100mg/kg,连续注射三天诱导糖尿病肾病。当小鼠糖尿病肾病模型构建成功后,利用免疫荧光双染方法检测糖尿病肾病小鼠肾小球中MYDGF的表达变化。第二部分:MYDGF在糖尿病肾病中的作用及机制初步探讨1.流式细胞术检测过表达MYDGF对AGE诱导的足细胞凋亡的影响体外培养HPC细胞,转染MYDGF过表达质粒后,给予AGE刺激48小时后,通过流式细胞术检测足细胞凋亡的水平。2.利用蛋白印迹方法检测过表达MYDGF对AGE诱导的足细胞损伤的影响。体外培养HPC细胞,转染MYDGF过表达质粒后,给予AGE刺激48小时,WB方法检测足细胞功能蛋白Podocin、WT1和Nephrin的表达水平。3.利用蛋白免疫印迹法检测过表达MYDGF对足细胞高糖条件下自噬水平的影响。体外培养HPC细胞,转染MYDGF过表达质粒后,给予AGE刺激48小时后,WB方法检测自噬相关蛋白ATG12、LC3 Ⅱ、P62、beclin-1、ATG5和VPS34的表达水平。4.利用基因芯片技术分析差异基因通过基因芯片技术分析AGE诱导的足细胞损伤组和MYDGF过表达组间的差异表达基因,并绘制Wnt家族分子热图。研究结果第一部分:MYDGF在糖尿病肾病中的表达变化1.在WT小鼠主要脏器中,肝脏和肾脏的MYDGF表达量相对较高;在不同肾脏实质细胞中RMC和GENC的MYDGF表达量相对较高首先对MYDGF在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器中的表达情况进行了表征,RT-PCR和Real-time RT-PCR结果显示MYDGFmRNA水平在肾脏和肝脏中的表达量相对较高,在心、脾、肺、脑中的表达量相对较低。MYDGF在RMC和GENC的表达量相对较高。2.STZ诱导的一型糖尿病肾病模型造模成功GLU、RKW和UACR结果显示:与对照组小鼠相比,STZ诱导的糖尿病肾病小鼠的GLU、RKW、UACR都明显升高。PAS染色结果也显示与对照组小鼠相比,STZ诱导的糖尿病肾病小鼠糖原沉积与系膜增生明显增加。IF实验结果也显示与对照组小鼠相比,STZ诱导的糖尿病肾病小鼠Nephrin和Podocin的表达量都明显降低。3.db/db小鼠模型符合二型糖尿病肾病模型GLU、RKW和UACR的结果显示:与对照组小鼠相比,db/db小鼠GLU、RKW、UACR都明显升高。PAS染色结果也显示与对照组小鼠相比,db/db小鼠糖原沉积与系膜增生明显增加。免疫荧光实验结果也显示与对照组小鼠相比,db/db小鼠Nephrin和Podocin的表达量都明显降低。4.MYDGF在糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达水平明显下降WB和Real-time RT-PCR结果表明,MYDGF在STZ诱导的糖尿病肾病模型组和db/db小鼠肾脏组织中与对照组相比表达显著下降。5.AGE刺激能够显著下调足细胞中MYDGF蛋白水平蛋白免疫印迹结果表明,AGE可以显著诱导HPC和MPC中的MYDGF的表达水平明显下调。HK-2中MYDGF蛋白表达也有所下降,但GENC和RMC中MYDGF蛋白表达没有明显的变化,表明MYDGF在高糖条件下具有相对细胞特异性的变化。6.AGE刺激显著下调人肾小球足细胞和小鼠肾小球足细胞上清液中MYDGF蛋白水平ELISA实验结果表明,在HPC和MPC的细胞上清液中MYDGF的表达均下降。在HK-2的细胞上清液中MYDGF蛋白也有所下降。在RMC和GENC细胞上清液中MYDGF的表达没有明显变化。7.MYDGF在糖尿病肾病小鼠肾小球足细胞中表达水平明显下调。虽然免疫荧光双标实验结果显示MYDGF在肾小球足细胞和肾小管中均有表达,但与对照组相比,由STZ诱导的糖尿病肾病小鼠,MYDGF在足细胞内下降更加显著。第二部分:MYDGF在糖尿病肾病中的作用及机制初步探讨1.MYDGF的过表达明显减轻AGE诱导的足细胞凋亡流式细胞术结果显示,AGE可以明显加重足细胞的凋亡,而过表达MYDGF可以明显改善足细胞的凋亡。2.MYDGF的过表达改善AGE诱导的足细胞损伤。Western blot结果显示,AGE可以明显下调Podocin和WT1的表达,而过表MYDGF可明显逆转Podocin和WT1的下调。3.MYDGF的过表达上调足细胞自噬水平。Western blot结果显示,AGE可以明显下调ATG12和LC3 Ⅱ的表达,而过表MYDGF可明显恢复ATG12和LC3 Ⅱ的表达。AGE可以明显上调P62的表达,而过表MYDGF可明显降低P62的表达。4.利用基因芯片技术分析差异基因通过基因芯片技术分析发现Wnt家族部分成员在AGE诱导的足细胞损伤组中表达明显降低,Wntl降低最明显。MYDGF的过表达可明显恢复损伤所诱导的这些基因的表达变化。结论与创新性:1.糖尿病肾病小鼠模型中MYDGF显著降低,并且在AGE刺激下足细胞内的MYDGF蛋白水平与上清中MYDGF 水平都明显下调,提示MYDGF与糖尿病肾病的发病机制密切相关,且可能参与足细胞的损伤。2.MYDGF可能通过调节自噬水平和足细胞凋亡,进一步发挥对足细胞及肾脏的保护作用。
【图文】：

MYDGF在小鼠各器官中年

骨髓源性生长因子（MYDGF）在糖尿病肾病足细胞损伤中的保护作用

db/db小鼠相关生理指标的表征
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9

【相似文献】