鸡枞菌通过抗氧化调节免疫及辅助治疗二型糖尿病及糖尿病肾病的研究

发布时间：2020-05-10 11:26

【摘要】：尿毒症是泌尿内外科治疗中难题之一。全球有超过4亿糖尿病患者,而糖尿病肾病作为糖尿病的严重并发症,约有40%的糖尿病患者继发糖尿病肾病,糖尿病肾病也是引起尿毒症等终末期肾病主要原因之一。虽然,器官移植被认为是比较理想的治疗措施,但我国目前尚存在巨大的供体器官缺口,大量终末期肾病患者难以得到及时的器官移植治疗。因此,有效地治疗糖尿病肾病,并延缓其进展为终末期肾疾病具有重大意义。免疫调节对于肾移植等具有重要意义,我科已经开展了一系列的研究,但免疫系统极其复杂,利用单一药物很难调控。中药具有作用温和、多靶点作用等特点,一直被期待成为改善免疫,保护细胞的药物之一。鸡枞菌(Termitornyces albuminosus(Berk)Heim),是我国名贵的药食两用大型真菌,具有增强机体免疫力,抗氧化,解酒保肝,抗肿瘤以及镇痛抗炎等多种药理活性。提示我们通过对鸡枞菌的深入研究,可能为防治糖尿病肾病,进而减少或延缓尿毒症等的发生提供新的可能。氧化应激在机体免疫力低下及糖尿病的病程中均发挥重要作用。Nrf2信号传导被认为是身体抵抗内部环境的氧化和化学刺激的重要防御转导途径,其调节HO-1和Keap1的表达水平。另外,NF-κB是一种普遍存在的转录因子,是炎症反应的主要调节因子,并易被许多特异性刺激物激活。此外,越来越多的证据表明,NF-κB是参与DN中许多相关途径变化的核心,例如肾素-血管紧张素系统的激活,AGE积累和NADPH依赖性氧化应激。但是肾病的发病机制极其复杂,包括免疫失调等多因素、多途径机制,需要进一步研究与探讨。因此,我们制备了鸡枞菌水提物,利用糖尿病db/db小鼠,在体内研究鸡枞菌可能通过抗氧化应激等的作用,将会有助于早期控制糖尿病等引起的肾损伤,避免发展成为尿毒症,延缓或避免肾移植。提出治疗糖尿病肾病等的药物机制,减少尿毒症的发生。方法:(1)采用化学计量学方法建立PT的有效成分含量的检测方法以及综合多糖、总黄酮和甘露醇含量建立期望函数,通过响应面方法进行分析,对PT的提取条件进行优化;并通过HPLC、UV、GC-MS等多种分析方法对鸡枞菌的主要成分进行检测。(2)运用CTX腹腔注射于Balb/c小鼠体内,诱导建立免疫抑制小鼠模型,然后经过14天的PT的灌胃给药治疗后,期间监测小鼠体重和脏器指数的变化并检测免疫抑制小鼠淋巴细胞的增殖以及NK细胞活性的改变;通过ELISA检测氧化应激因子、炎症因子以及免疫球蛋白;通过Western Blotting实验检测免疫抑制小鼠中Nrf2、HO-1、SOD1、Keap-1和CAT等氧化应激相关蛋白的表达。(3)采用db/db小鼠进行糖尿病小鼠实验。将PT对db/db小鼠进行灌胃给药治疗持续8周,在这期间每隔一周进行称重及测血糖;通过病理切片观察PT给药后,db/db小鼠的胰岛形态,胰岛细胞数量,肾小球系膜基膜厚度,肾小管空泡的数量,肝细胞变性情况;通过ELISA检测小鼠的糖代谢相关因子、脂代谢相关因子、DN相关因子以及氧化应激相关因子的表达;通过抗体芯片筛选小鼠肾脏主要炎性因子,并通过ELISA试剂盒检测筛选出的炎性因子水平变化;通过Western Blotting实验,检测db/db小鼠肾脏组织中JAK2、STAT3、IKKα+β、IKBα、NF-κB和AKT1/2/3蛋白活性表达水平。结果:(1)优化的结果提示在三因子三水平条件下,提取温度为88.9℃、提取时间为3.63h,提取料液比为1:25.8和提取次数为2次的条件时PT期望值最高。通过HPLC、UV、GC-MS等多种分析方法对鸡枞菌的主要成分进行检测后,结果可以发现鸡枞菌中含量最多的是蛋白质,约占39.7%,其次是可溶性的总糖,约占30.0%,第三是还原糖,约占鸡枞菌含量的10.0%。除此之外,鸡枞菌中还有0.029%的总黄酮,0.2%的粗脂肪,0.023%的总三萜以及2.569%的甘露醇等成分。(2)CTX腹腔注射诱导建立免疫抑制小鼠模型,并经过14天的PT的灌胃给药治疗后,其结果发现相比于免疫抑制小鼠,PT能够明显改善免疫抑制小鼠体重和脏器指数的变化,促进免疫抑制小鼠淋巴细胞的增殖以及NK细胞活性的增强;ELISA检测结果表明PT能够显著增加免疫抑制小鼠血清和脾脏中的SOD、CAT、GSH-PX、IL-2、IL-6、IL-10、IFN-α、IFN-γ、IgA、IgG的表达水平,而对MDA、ROS的含量表达具有明显的抑制作用;Western Blotting实验的结果表明PT能够显著促进免疫抑制小鼠脾脏中Nrf2、HO-1、SOD1和CAT的蛋白表达,而对Keap-1的蛋白表达水平具有明显的抑制作用。(3)结果发现PT能够有效的抑制db/db小鼠体重过度增长和血糖含量的增高,降低小鼠的摄食量和摄水量,并且能够抑制小鼠的胰岛素抵抗状态,改善胰岛素的敏感性,进而改善血糖代谢功能;通过病理切片实验可以看到经过PT给药后,db/db小鼠的胰岛形态恢复至接近圆形,胰岛细胞数量减少,肾小球系膜基膜厚度降低,肾小管空泡减少,肝细胞变性缓解;ELISA检测的结果表明PT对小鼠血清中INS、ATP、HDL-C和ALB以及肾脏中PK、MMP-9、6-K-PGF1α、CAT、SOD和GSH-Px的含量表达水平具有促进作用,而明显抑制了血清中GhbAlc、LDL-C和BUN,尿液中NAG以及肾脏中PKA和ROS的含量表达;抗体芯片筛选的结果提示,PT能够促进糖尿病小鼠32种炎性因子的含量显著升高,对5种炎性因子的含量明显下降;ELISA试剂盒的检测结果提示PT显著降低了db/db小鼠肾脏中TNF-α、IL-2、NF-κB、TSG-14、CHI3L1、IL-12和IFN-γ的表达水平,而增加了IL-4的表达水平,与抗体芯片的结果相一致,证明PT能够调节肾脏中炎性因子的水平,发挥抑制炎症的作用,改善DN。Western Blotting的结果发现PT可以降低db/db小鼠肾脏组织中JAK2、STAT3、IKKα+β、IKBα、NF-κB和AKT1/2/3蛋白活性表达水平。结论:1.PT可以增强免疫细胞的功能,促进免疫相关因子的表达,调节免疫功能,发挥保护作用。2.通过小鼠体重的改变,血糖的变化,摄食摄水行为的改变,大体标本的改变,血BUN、蛋白尿及肾相关炎症因子的变化,证明可以减轻肾损伤。3.通过INS、ATP、HDL-C、LDL-C和ALB以及肾脏中PK、MMP-9、6-K-PGF1α等的变化,提示鸡枞菌水提物可能通过多种途径发挥保护作用。4.通过SOD、CAT、GSH-Px、JAK2、STAT3、IKKα+β、IKBα、NF-κB和AKT1/2/3等的变化,可以反映出,可能是通过JAK/STAT3途径与NF-κB途径,发挥抗氧化应激、调节血糖、血脂水平以及抗炎的作用进而来达到辅助治疗二型糖尿病及DN的作用。因此,本实验通过体内外实验,初步阐明了鸡蘑所含活性成分通过多种途径减轻细胞损伤的机制,同时,也为探索糖尿病等引起的肾损伤提供了理论与实验依据。
【图文】：

曲线,总糖含量,检测标准,曲线

溴甲酚绿，石油醚，海砂，乙酸锌和亚铁氰化钾等均为方法有效成分含量检测方法中总糖含量的测定萄糖标准曲线的绘制取葡萄糖标准溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 m瓶中用水定容至刻度，摇匀。准确吸取上述葡萄糖标准溶液于 1 mL 苯酚溶液充分混合，迅速加入 5 mL 浓硫酸充分混合，室0 nm 的条件下，以空白溶液作为对照组，测定吸 OD 值。记录为横坐标，A490 为纵坐标，绘制标准曲线。

曲线,还原糖含量,检测标准,曲线

样溶液的测定取待测液，加入比色管中，加入 1 mL 苯酚溶液充分混合，迅混合，室温下放置 30 min，在 490 nm 波长下，以 0 管为参比，线如图 2.1 所示，根据回归方程计算获得总糖含量。中还原糖含量的测定准曲线的制作葡萄糖试剂，在烘箱中 100℃温度下鼓风干燥，至重量不变， 1 mg/mL 即成标准溶液。取 0，0.1，0.2，0.3，0.4 和 0.5 mL 水，稀释至 0.5 mL。摇匀后加入 1.5 mL 的 DNS 试剂，再次摇于冷水中使其充分冷却。每管中再加入 4 mL 去离子水混匀，D 值，，经过计算得到标准曲线。标准曲线如图 2.2 所示。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R692.9

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