ATF4通过调节Parkin减轻棕榈酸诱导的肾小球足细胞凋亡

发布时间：2020-05-21 05:09

【摘要】：研究背景慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)患者体内常存在脂代谢异常,且其在加重慢性肾脏病进展中起着重要作用。肾小球足细胞在维持肾小球滤过屏障的正常生理功能当中,发挥了非常重要作用。足细胞的损伤、脱落和凋亡是高脂导致肾脏损害的重要机制。内质网应激是通过激活未折叠蛋白反应,继而激活转录激活因子4(activating transcription factor-4,ATF4)、转录激活因子 6(activating transcription factor-6,ATF6)和,肌醇需求激酶-1(inositolrequiring enzyme-1,IRE1)的表达上调,从而抑制蛋白质的转录翻译,同时促进未折叠或错误折叠蛋白质的正确折叠,从而维持细胞的稳态,增加细胞的抗损伤能力。若内质网应激持续过度激活,则会启动细胞凋亡。既往有研究发现,ATF4可以从转录水平调节Parkin的表达。而Parkin与线粒体自噬以及细胞凋亡的关系密切。但是ATF4是是否可通过调节Parkin的表达在高脂诱导的肾小球足细胞凋亡中发挥保护作用仍不清楚,有待于进一步研究。目的本文研究了 ATF4通过调节Parkin在棕榈酸诱导引起的肾小球足细胞凋亡中的作用,以阐明内内质网应激在高脂诱导的足细胞凋亡中的作用,为临床防治脂质肾毒性提供新的实验依据和理论支持。方法20只雄性SD大鼠随机分为两组:分别为普通饲料喂养的普通饮食组(N=10)及高脂饲料喂养的高脂饮食组(N=10),喂养12周后,处死动物,取其血清及肾脏标本,送检验科检测血清胆固醇及甘油三酯水平。采用油红“O”染色法,观察肾脏组织内脂质集聚的情况。在体外培养小鼠足细胞株,待其分化完全后,用不同浓度PA刺激。采用Western印迹检测肾组织及PA诱导的足细胞凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3表达,并采用Tunel染色法、流式细胞术分别观察肾脏组织及PA诱导的足细胞的凋亡的情况;采用免疫组化和Western印迹的方法,观察动物肾脏组织及PA诱导的足细胞Parkin及ATF4的表达。采用Parkin过表达质粒体外转染足细胞,或shATF4腺病毒体外转染足细胞,观察其对PA诱导的足细胞Parkin及其细胞凋亡的影响。结果(1)高脂饮食组血清甘油三酯及胆固醇水平显著高于普通饮食组。此外,高脂饮食组肾小球有轻微的系膜增生,肾小管上皮细胞有脱落、坏死和凋亡、肾小管萎缩;高脂饮食组肾脏脂质集聚增多,细胞凋亡增加。(2)在一定浓度范围内,PA可增加足细胞的凋亡和Cleaved-caspase3蛋白的表达,且呈浓度依耐性。(3)与普通饮食组相比,高脂饮食组动物肾脏Parkin的表达明显升高。同时,PA在一定浓度范围内可呈浓度依赖性诱导足细胞Parkin的表达升高。(4)Parkin过表达质粒体外转染足细胞后,可明显减少PA诱导的足细胞凋亡。(5)与普通饮食组相比,高脂饮食组动物肾脏ATF4的表达明显升高。同时,PA在一定浓度范围内可呈浓度依赖性诱导足细胞ATF4的表达升高。(6)采用shATF4腺病毒转染足细胞后,足细胞内Parkin的表达下降,同时PA刺激的Cleaved-caspase3的表达升高及其细胞凋亡更为明显,差异有统计学意义。结论(1)高脂可诱导肾脏损伤、脂质集聚、ATF4和Parkin表达升高以及凋亡增多。(2)PA可诱导足细胞ATF4和Parkin表达升高以及凋亡增多。(3)ATF4可通过维持Parkin的表达从而改善PA诱导的足细胞凋亡。
【图文】：

氧化应激中发挥了重要作用。但是Ｐａｒｋｉｎ是否参与高脂诱导的肾脏组织和足细胞逡逑凋亡的发生，仍未见报道。我们采用免疫组织化学染色和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ，发现高脂逡逑饮食喂养的大鼠肾脏Ｐａｒｋｉｎ的表达较普通饮食组明显升高（尸＜０．０５）（见图３．３Ａ、逡逑Ｂ邋及邋Ｃ、Ｄ）0逡逑同样，在体外实验中，我们采用ＰＡ刺激肾小球足细胞２４小时，免疫荧光染逡逑色技术发现，，与正常对照组相比，ＰＡ组足细胞Ｐａｒｋｉｎ的表达较正常对照组升高逡逑２１逡逑

逡逑（尸＜０．０５）（见图３．３Ｅ、Ｆ）；进一步采用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ技术检测发现ＰＡ在一定浓逡逑度范围内可呈浓度依赖性地诱导足细胞Ｐａｒｋｉｎ表达升高（Ｐ＜０．０５）（见图３．３Ｇ、Ｈ）。逡逑Ａ逦ＮＣＤ逦ＨＦＤ逦Ｂ逡逑ｇ邋ｈ逦＿逡逑一逦Ｉｓ－逦±逡逑｜逦ｉ－逦Ｉ逡逑－逦ｉＬＪＬ逡逑Ｃ逦Ｄ邋Ｃ邋２０－逡逑逦ＮＣＤ逦ＨＦＤ逦邋｜邋１－５－逡逑—二二二二Ｉ逦ｉ逦你逦＿逦＿逡逑ｐ－ａｃｔ邋叫—￡逦Ｓｉ逦ＳＳｆｔＷ逡逑ｉ＾曹懌■曹r>ｉ逦ｉ－５渞逡逑ｉ。N灥＿＿圈＿逡逑Ｅ邋＾＾ＤＡＰ＾＾＾＾Ｐａｒｋｉｒ＾＾＾ｌＶｌｅｒｇ＾＾＾邋ｐ逦，逦爹逡逑ｃｔｒ＾Ｈ＾ｍ邋ｉ逡逑ｉ邋２－逦１逡逑ｉ邋Ｊｐ逦Ｉ，逡逑Ｇ逦Ｈ邋＝邋２５ｌ逡逑逦ＰＡ（，ｏｌ／Ｌ＞逦邋！邋，0．逦ｌ逡逑＿邋０逦＿－Ｊ５０逦３００逦Ｉ邋１５．忐－｜逡逑Ｐａｒ１邋一邋口邋Ｓ：ｎｌｌ逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ逦１邋Ｊ１邋ｉ邋Ｗ邋ＩＩＩ逡逑逦Ｉ逦。屮＃＃逡逑ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐａｌｍｉｔｉｃ邋ａｃｉｄ（（ｉｍｏｌ／Ｌ）逡逑图３．３高脂饮食及ＰＡ诱导Ｐａｒｋｉｎ表达增加逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．３邋Ｈｉｇｈ邋ｆａｔ邋ｄｉｅｔ邋ａｎｄ邋ｐａｌｍｉｔｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｐａｒｋｉｎ逡逑高脂饮食喂养ＳＤ大鼠１２周。ＮＣＤ：普通饮食喂养大鼠组（Ｎｏｒｍａｌ邋ｃｈｏｗ邋ｄｉｅｔ）；逡逑ＨＦＤ组：高脂饮食喂养大鼠组（Ｈｉｇｈ邋ｆａｔ邋ｄｉｅｔ）。（Ａ）懫用免疫组织化学染色法检测大逡逑鼠肾脏组织Ｐａｒｋｉｎ的表达（４０0ｘ）；邋（Ｂ）对Ａ图进行统计分析
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

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本文编号：2673768