间隙连接蛋白43通过内质网应激和氧化应激调控足细胞损伤的作用和机制研究

发布时间：2020-05-25 16:51

【摘要】：(1)体内研究目的:建立醛固酮诱导的大鼠肾损伤模型,体内观察Cx43、氧化应激和ERS对足细胞的作用。方法:将24只雄性SD大鼠随机分为四组:对照组(n=6,假手术组,1%Na Cl饮水);醛固酮模型组(n=6,右肾摘除术,1%Na Cl饮水,两周后醛固酮微泵以0.75μg/h持续泵入);醛固酮+Cx43 SCR组(n=6,右肾摘除术,1%Na Cl饮水,两周后醛固酮微泵以0.75μg/h持续泵入,50μMCx43 SCR的微泵);醛固酮+Cx43 AS组(n=6,右肾摘除术,1%Na Cl饮水,两周后醛固酮微泵以0.75μg/h持续泵入,50μMCx43 AS的微泵)。实验开始时及第4周测量大鼠尾动脉收缩压,实验第4周结束前一天开始使用代谢笼收集大鼠24小时尿液,测定尿蛋白排泄率(ELISA法);肾组织石蜡固定,病理切片,检测肾小球内足细胞的凋亡情况(TUNEL法);检测肾小球Cx43、Casepase12、WT1和NOX4变化(免疫荧光和免疫组化法);Western blot法检测肾组织中Caspase12、GRP78、NOX4、Cx43、Bax和Bcl-2等表达水平的变化。DHE染色检测肾脏活性氧的产生。结果:与对照组相比,醛固酮模型组收缩压、24小时尿量、尿蛋白/肌酐、肾重量/体重值均明显增高,氧化应激指标(DHE染色和NOX4表达)升高,ERS标志蛋白(GRP78和Caspase12)的表达升高,Cx43表达升高。同时,醛固酮模型组TUNEL法检测足细胞凋亡数明显增多,免疫荧光WT1染色提示阳性细胞数明显减少,上述结果均提示足细胞损伤。与醛固酮+Cx43 SCR组相比,Cx43 AS干预组Cx43表达减少,TUNEL法提示足细胞凋亡数减少,WT1染色阳性细胞数增多,氧化应激指标(DHE染色)降低,ERS标志蛋白(GRP78和Caspase12)的表达降低。(2)体外研究目的:体外培养大鼠足细胞,醛固酮干预后观察氧化应激、ERS和Cx43在足细胞损伤中的作用。方法:体外培养足细胞株(MPC5),无干扰素-γ、37°C条件下诱导分化10~14d,不同浓度醛固酮(10-9M、10-8M、10-7M)和10-7 M醛固酮刺激足细胞12、24、36h等不同时间点,Western blot法检测Cx43、GRP78和Caspase12等表达,结合使用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,氧化应激抑制剂)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA,ERS抑制剂)以及si RNA下调Cx43表达后,细胞凋亡酶联免疫检测试剂盒检测足细胞凋亡情况,Western blot法检测GRP78、Caspase12、Bax和Bcl-2等表达变化,DCFDA探针检测细胞活性氧含量。结果:醛固酮可呈浓度(10-9M、10-8M、10-7M)和时间(12h、24h、36h)依赖性的促进Cx43表达;10-7M醛固酮刺激足细胞24h后,足细胞凋亡、ROS含量、内质网应激标志蛋白(GRP78和Caspase12)、Bax/Bcl-2表达水平均明显升高,NAC特异性抑制氧化应激反应后,可减轻醛固酮诱导的内质网应激和足细胞损伤,TUDCA特异性抑制内质网应激后,可减轻醛固酮诱导的氧化应激和足细胞损伤,si RNA特异性下调Cx43后,可减轻醛固酮诱导的氧化应激、ERS和足细胞损伤。小结:(1)过度的内质网应激参与了醛固酮诱导的足细胞损伤;(2)氧化应激的上调参与了醛固酮诱导的足细胞损伤;(3)醛固酮诱导的足细胞损伤中,内质网应激与氧化应激相互作用,相互影响;(4)Cx43的表达上调参与了醛固酮诱导的足细胞损伤;(5)Cx43可通过氧化应激和内质网应激调控醛固酮诱导的足细胞损伤。
【图文】：

大鼠,参数,尿白蛋白,体重比

14图 1 各组大鼠基本情况参数。（A）体重；（B）尿醛固酮水平；（C）尿量；（D）肾重量/体重比；（E）收；（F）尿白蛋白/肌酐；#P<0.05 vs. normal control,*P<0.05 vs. Aldo/salts or 3 SCR.1.4.2 醛固酮诱导大鼠足细胞损伤与对照组相比，Aldo/salt 组肾小球足细胞凋亡数显著增加，详见图 2A、B，

足细胞,醛固酮,大鼠

图 2：醛固酮增加大鼠足细胞损伤。A：TUNEL 检测大鼠足细胞凋亡；B：肾小球足细胞凋亡数目统计分析结果图；C：WT1 阳性细胞数；D：肾小球足细胞数目统计分析结果图；#P<0.05 vs. normal control.1.4.3Cx43 表达上调参与醛固酮诱导的大鼠足细胞损伤免疫荧光结果显示：和对照组相比，Aldo/salt 组肾小球内 Cx43 表达增多，详见图 3A，此外 Cx43 和足细胞标志蛋白 Nephrin 共定位，这表明醛固酮激活了足细胞Cx43 信号通路。Western blot 结果表明醛固酮诱导的大鼠肾损伤模型中肾小球内 Cx43表达增多，详见图 3B，C。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

【参考文献】