eATP-P2X7R信号在肾缺血再灌注性损伤中的作用机制

发布时间：2020-05-25 18:28

【摘要】：目的:1.探索细胞外ATP在肾缺血再灌注性损伤(I/R)中的作用,明确其是否可以诱导肾脏炎症;2.观察e ATP是否通过P2X7R诱导肾小管上皮细胞炎症;3.探索e ATP/P2X7R是否通过NLRP3炎症体参与肾脏I/R损伤。方法:体内实验:雄性C57BL/6小鼠及P2X7R(-/-)小鼠随机分为假手术组(Sham)和I/R组,野生型小鼠术后30min尾静脉注射Apyrase或A438079治疗。通过一侧肾切对侧肾蒂夹闭35min建立AKI模型。造模后24h收集小鼠尿、血清及肾组织。体外实验:体外培养人肾小管上皮细胞(HK2),予低氧24h/复氧8h(H/R)或ATP 4m M 8h处理。给予不同浓度Apyrase处理。通过转染P2X7R si RNA或NLRP3si RNA观察P2X7R及NLRP3对细胞H/R及ATP损伤的影响。生化方法检测小鼠血清肌酐、尿素氮水平。PAS染色观察肾结构损害;化学发光法检测尿及细胞上清ATP水平;免疫组化或免疫荧光染色定位肾组织ATP5a、ATP5b、IL-18、cleaved caspase-1、F4/80、IL-1 beta、CD68、P2X7R、NLRP3的表达;real-time PCR及免疫印迹检测肾组织ATP合成酶、P2X7R、NLRP3炎症体、IL-1 beta的基因及蛋白表达水平。结果:体内实验:肾脏I/R诱导小鼠尿ATP水平升高但ATP合酶表达无明显变化。I/R小鼠肾功能下降,肾脏结构损害,炎症因子及炎症细胞浸润增加,Apyrase治疗后改善。I/R组小鼠肾脏NLRP3、cleaved caspase-1水平增多,Apyrase或A438079治疗后降低。另外,P2X7R(-/-)I/R小鼠肾功能、肾脏炎症因子及因子细胞浸润较野生型小鼠相比明显改善。体外实验:H/R诱导HK2细胞ATP释放增多,IL-1 beta m RNA及IL-1 beta蛋白活化水平增加,Apyrase处理后改善,P2X7R si RNA转染或NLRP3 si RNA转染后改善。P2X7R si RNA转染还降低H/R诱导的NLRP3、ASC、cleaved caspase-1表达升高。结论:降低细胞外ATP水平或P2X7R基因敲除通过抑制肾小管上皮细胞NLRP3炎症体活化改善肾脏缺血再灌注损伤,并降低肾脏炎症。
【图文】：

后肾,功能,小鼠,因子表

43 图 1.1 小鼠肾脏 I/R 后肾功能及组织学改变。C57BL/6 小鼠随机分为 Sham 组及 I/R 组。A.肾功能；B.PAS 染（200X，上组图）及 IL-18 免疫组化染（200X，，下组图）。***表示和 Sham 组比较，p<0.001。白箭头显示肾小管上皮细胞坏死、脱落、堵塞管腔、基底膜裸露；箭头显示小管间质炎症细胞浸润。Figure 1.1 The changes of renal function and histopathology after renal I/R injury.1.2.1.2 I/R 诱导小鼠肾组织炎症因子表达增多、炎症细胞浸润增加如图 1.2A 所示，小鼠经肾脏 I/R 损伤后肾组织 IL-1 beta mRNA 表达水平和 Sham 组小鼠相比增多约 3 倍（p<0.01）。如图 1.2B 所示，I/R 组小鼠肾组织IL-1 beta 前体蛋白（p31 片段）表达和 Sham 组相比增加，同时 IL-1 beta 的

免疫荧光,小鼠,细胞浸润,间质

活化片段（p17）也较 Sham 组小鼠增加。免疫荧光结果(图 1.2C)显示，I/R 组小鼠肾间质 F4/80＋炎症细胞浸润数量较 Sham 组相比明显增加。同时 CD68 和 IL-1 beta 免疫荧光共染结果显示 I/R组小鼠 IL-1 beta 表达水平增高，CD68＋细胞浸润增多，并且 IL-1 beta 和 CD68聚集在相似区域。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692

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